6.Normalisierungen

Aufgabe 1: Grundlagen

a. Warum ist es notwendig RNASeq Daten zu normalisieren?

Die Normalisierung von RNASeq Daten ist notwendig, um die Genexpression quantifizieren zu können und diese von verschiedenen Genen miteinander vergleichen zu können. Da die erhaltenen Daten meist sehr unterschiedlich sind, aufgrund verschiedener Genlängen und Sequenziertiefen etc., müssen diese erst durch die Normalisierungen aneinander angeglichen werden, um einen aussagekräftigen Vergleich möglich zu machen.

b. Rolle der Sequenziertiefe und Genlänge

Die Sequenziertiefen und Genlängen müssen normalisiert werden, um die erhaltenen RNASeq Daten miteinander vergleichen zu können, da diese oft sehr unterschiedlich sind und das die Auswertung beeinflussen kann. So erhält man für längere Gene möglicherweise mehr reads, als für kürzere Gene, obwohl die Genexpression gleich ist, würde man da fälschlicherweise annehmen, dass das längere Gen stärker exprimiert wird. Bei einer hohen Sequenziertiefe erhält man mehr reads, als bei einer niedrigen Sequenziertiefe, dabei muss das Verhältnis der erhaltenen reads für ein Gen, zu der Gesamtzahl an reads einer Sequenzierung beachtet werden. Dies ist durch Normalisierungen möglich.

Aufgabe 2: RPKM und TPM

Gen & Genlänge (L)	Counts (c) Replikat 1	Counts (c) Replikat 2
A (7 kb)	5	16
B (12 kb)	10	36
C (0,5 kb)	2	8
D (25 kb)	1	0

a. Normalisierung mit RPKM

• RPKM steht für 'Reads per kilobase of transcript per Million mapped reads'
• Für die Normalisierung wird die Formel [math]\displaystyle{ RPKM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i} \cdot N} }[/math] verwendet.

Parameter:
c_i = Anzahl an ausrichtbaren reads für ein Transkript 'i'
L_i = Länge des Transkripts/Gens 'i' in kbp
N = Gesamtanzahl an ausrichtbaren reads in Millionen

 [math]\displaystyle{    \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}}  }[/math]  → Normalisierung der Genlänge 

 [math]\displaystyle{  L_\text{i} \cdot N  }[/math] → Normalisierung der Sequenziertiefe 

In dieser Aufgabe:
c = siehe Tabelle
L = siehe Tabelle
N (Replikat 1) = 18 | N (Replikat 2) = 60
Beispiel Gen A, Replikat 1:
[math]\displaystyle{ RPKM (A1) = \frac{ 5}{7 kb \cdot 18} = 0,0397 }[/math]

Gen	RPKM Replikat 1	RPKM Replikat 2
A	0,0397	0,0381
B	0,0463	0,05
C	0,2222	0,2667
D	0,0022	0

• Ein hoher RPKM Wert, sagt aus, dass die Genexpression stärker ist, als bei einem niedrigeren RPKM Wert.
• Zum Vergleich der Genexpression innerhalb einer Probe, können die RPKM Werte gut genutzt werden, sie sind jedoch nicht dafür geeignet Genexpressionen von Genen verschiedener Proben miteinander zu vergleichen, da die Bedingungen meist sehr unterschiedlich sind und falsche Aussagen über die Genexpressionen gemacht werden können.

b. Normalisierung mit TPM

• TPM steht für 'Transcripts per Million.
• Wenn 1 Millionen Transkripte sequenziert werden würden, wäre TPMi die Anzahl an Transkripten des Typs 'i'.
• Im gegensatz zu RPKM wird L in Basenpaaren, statt in Kilobasenpaaren, angegeben.
  
• Anders, als bei der Normalisierung mit RPKM wird erst die Genlänge und dann die Sequenziertiefe normalisiert.
• Für die Normalisierung wird die Formel [math]\displaystyle{ TPM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}} \cdot \dfrac {1}{\sum_\text{n} \dfrac {c_\text{n}}{L_\text{n}}} \cdot 10^6 }[/math] verwendet.

Parameter:
c_i = Anzahl an ausrichtbaren reads für ein Transkript 'i'
L_i = Länge des Transkripts/Gens 'i' in kbp
N = Gesamtanzahl an ausrichtbaren reads in Millionen
Beispiel Gen A, Replikat 1:
[math]\displaystyle{ TPM (A1) = \frac{ 5}{7000} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {5}{7000} + \dfrac {10}{12000} + \dfrac {2}{500} + \dfrac {1}{25000}} \cdot 10^6 = 127834 }[/math]

Gen	TPM Replikat 1	TPM Replikat 2
A	127834	107383
B	149139	140940
C	715868	751678
D	7159	0

c. Anwendungsbereich

RPKM und TPM werden genutzt um die Expression verschiedener Gene, aus der gleichen Probe, einer RNA Sequenzierung miteinander zu vergleichen.

a. Normalisierungsmethode

Für die Normalisierung zwischen Proben wird TMM eingesetzt. TMM steht für 'Trimmed mean of M – Values normalization method'.

b. Wieso wird die Normalisierung bei RNASeq-Proben angewendet?

TMM wird für die Normalisierung von RNASeq-Daten angewendet, um die Expression eines Gens unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, z.B. ob es in Krebszellen stärker, oder schwächer exprimiert wird, als in gesunden Zellen.

c. Normalisierung mit TMM

1. Der Gewichtungsfaktor für das Expressionsverhältnis für Gen 'g' zwischen Probe 'k' ' und 'k' wird bestimmt. Dabei werden kleinere Werte verstärkt und große abgeschwächt.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ W_\text{gk}^\text{k`} = \frac{ N_\text{k} - Y_\text{gk}}{N_\text{k} \cdot Y_\text{gk}} + \frac{ N_\text{k`} - Y_\text{gk`}}{N_\text{k`} \cdot Y_\text{gk`}} }[/math]	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

2. Der Mittelwert aller Expressionsverhältnisse wird berechnet.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} = log_2 \dfrac { \dfrac {Y_\text{gk}}{N_\text{k}}}{ \dfrac {Y_\text{gk`}}{N_\text{k`}}} }[/math]	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

3. Die gewichteten Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse werden berechnet. Einsetzen der in 1. und 2. ermittelten Werte.

[math]\displaystyle{ TMM = 2^{log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`})} }[/math]

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`}) = \frac{ \underset {g \in G}{\sum} W_\text{gk}^\text{k´} \cdot M_\text{gk}^\text{k´}} { \sum_{g \in G} W_\text{gk}^\text{k´}} }[/math]	[math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} = }[/math] Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse [math]\displaystyle{ W_\text{gk}^\text{k`} = }[/math] Gewichtungsfaktor der Expressionsverhältnisse G = Set aller Gene

Bedingungen für dieses Verfahren:

• Y_gk , Y_gk' > 0
• Die oberen und unteren 30 % der [math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} }[/math] Werte werden nicht berücksichtigt
• Die 5 % am höchsten und niedrigsten exprimierten Gene werden nicht berücksichtigt