6.Normalisierungen

Aufgabe 1: Grundlagen

a: Warum ist es notwendig RNASeq Daten zu normalisieren?

• Eliminieren von statischen Abweichungen, die durch z.B. verschiedene Durchführungsrunden, unterschiedliche Bedingungen, Laborausstattung, Experimentatoren, … entstehen
• Heterologe Geneigenschaften können zu unterschiedlichen Ergebnissen bei eigentlich gleicher Genexpression führen
• Vergleichbarkeit von Proben ermöglichen

b: Rolle der Sequenziertiefe und Genlänge

Die Sequenziertiefen und Genlängen müssen normalisiert werden, um die erhaltenen RNASeq Daten miteinander vergleichen zu können, da diese oft sehr unterschiedlich sind und das die Auswertung beeinflussen kann. So erhält man für längere Gene möglicherweise mehr reads, als für kürzere Gene, obwohl die Genexpression gleich ist. Der Fehlschluss liegt nah, dass das längere Gen stärker exprimiert wird. Bei einer hohen Sequenziertiefe erhält man mehr reads, als bei einer niedrigen Sequenziertiefe. Dabei muss das Verhältnis der erhaltenen reads für ein Gen, zu der Gesamtzahl an reads einer Sequenzierung betrachtet werden. Dies ist durch Normalisierungen möglich.

Aufgabe 2: RPKM und TPM

Gen & Genlänge (L)	Counts (c) Replikat 1	Counts (c) Replikat 2
A (7 kb)	5	16
B (12 kb)	10	36
C (0,5 kb)	2	8
D (25 kb)	1	0

a: Normalisierung mit RPKM

• RPKM steht für 'Reads per kilobase of transcript per Million mapped reads'
• Für die Normalisierung wird die Formel Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle RPKM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i} \cdot N} * 10^6 } verwendet.

Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle    \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}} }
  → Normalisierung der Genlänge 

Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle  L_\text{i} \cdot N }
 → Normalisierung der Sequenziertiefe 

Beispiel Gen A, Replikat 1:
Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle RPKM (A1) = \frac{ 5}{7 kb \cdot 18} * 10^6 = 3,97 * 10^4}

Gen	RPKM Replikat 1	RPKM Replikat 2
A	3,97 * 10^4	3,81 * 10^4
B	4,63 * 10^4	5 * 10^4
C	2,222 * 10^5	2,667 * 10^5
D	2,2 * 10^3	0

• Ein hoher RPKM Wert, sagt aus, dass die Genexpression stärker ist, als bei einem niedrigeren RPKM Wert, indem die Größe des Gens berücksichtigt wird.
• Zum Vergleich der Genexpression innerhalb einer Probe, können die RPKM Werte genutzt werden, sie sind jedoch nicht dafür geeignet Genexpressionen von Genen verschiedener Proben miteinander zu vergleichen, da die Bedingungen meist sehr unterschiedlich sind und falsche Aussagen über die Genexpressionen gemacht werden können. Die Summe aller RPKMs ergibt nicht 100 % und kann somit keine Anteile am Ganzen widerspiegeln.

b: Normalisierung mit TPM

• TPM steht für 'Transcripts per Million.
• Wenn 1 Millionen Transkripte sequenziert werden würden, wäre TPMi die Anzahl an Transkripten des Typs 'i'.
• Bei TPM wird außerdem die totale Anzahl an reads nicht berücksichtigt.
  
• Anders, als bei der Normalisierung mit RPKM wird erst die Genlänge und dann die Sequenziertiefe normalisiert.
• TPM berechnet das Verhältnis zwischen den Ergebnissen und die Werte in jeder Spalte ergeben 1 Million.
• Für die Normalisierung wird die Formel Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle TPM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}} \cdot \dfrac {1}{\sum_\text{n} \dfrac {c_\text{n}}{L_\text{n}}} \cdot 10^6 } verwendet.

Parameter:
c_i = Anzahl an ausrichtbaren reads für ein Transkript 'i'
L_i = Länge des Transkripts/Gens 'i' in bp
N = Gesamtanzahl an ausrichtbaren reads in Millionen

Beispiel Gen A, Replikat 1:
Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle TPM (A1) = \frac{ 5}{7000} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {5}{7000} + \dfrac {10}{12000} + \dfrac {2}{500} + \dfrac {1}{25000}} \cdot 10^6 = 127834 }

Gen	TPM Replikat 1	TPM Replikat 2
A	127834	107383
B	149139	140940
C	715868	751678
D	7159	0

c: Anwendungsbereich

RPKM und TPM werden genutzt um die Expression verschiedener Gene, aus der gleichen Probe, einer RNA Sequenzierung miteinander zu vergleichen. Sie sind also Normalisierungsverfahren innerhalb einer Probe.

a: Normalisierungsmethode

Für die Normalisierung zwischen Proben wird TMM eingesetzt. TMM steht für 'Trimmed mean of M – Values normalization method'.

b: Wieso wird die Normalisierung bei RNASeq-Proben angewendet?

• Um das relative RNA-Produktionsniveau aus RNASeq-Daten abzuschätzen
• Es können heterologe Geneigenschaften zwischen 2 Proben auftauchen und eine identische Genexpression, fälschlicherweise, als unterschiedlich erkannt werden
• Beispiel: Expression zwischen gesunden und kranken Patienten soll auf bestimmte Marker untersucht werden

c. Normalisierung mit TMM

1. Der Gewichtungsfaktor für das Expressionsverhältnis für Gen 'g' zwischen Probe 'k' ' und 'k' wird bestimmt. Dabei werden kleinere Werte verstärkt und große abgeschwächt.

Formel	Parameter
Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle W_\text{gk}^\text{k`} = \frac{ N_\text{k} - Y_\text{gk}}{N_\text{k} \cdot Y_\text{gk}} + \frac{ N_\text{k`} - Y_\text{gk`}}{N_\text{k`} \cdot Y_\text{gk`}} }	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

2. Der Mittelwert aller Expressionsverhältnisse wird berechnet.

Formel	Parameter
Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle M_\text{gk}^\text{k`} = log_2 \dfrac { \dfrac {Y_\text{gk}}{N_\text{k}}}{ \dfrac {Y_\text{gk`}}{N_\text{k`}}} }	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

3. Die gewichteten Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse werden berechnet. Einsetzen der in 1. und 2. ermittelten Werte.

Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle TMM = 2^{log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`})} }

Formel

Parameter

Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`}) = \frac{ \underset {g \in G}{\sum} W_\text{gk}^\text{k´} \cdot M_\text{gk}^\text{k´}} { \sum_{g \in G} W_\text{gk}^\text{k´}} }

Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle M_\text{gk}^\text{k`} = } Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle W_\text{gk}^\text{k`} = } Gewichtungsfaktor der Expressionsverhältnisse G = Menge aller Gene

Bedingungen für dieses Verfahren:

• Y_gk , Y_gk' > 0
• Die oberen und unteren 30 % der Failed to parse (SVG (MathML can be enabled via browser plugin): Invalid response ("Math extension cannot connect to Restbase.") from server "https://wikimedia.org/api/rest_v1/":): {\displaystyle M_\text{gk}^\text{k`} } Werte werden nicht berücksichtigt
• Die 5 % am höchsten und niedrigsten exprimierten Gene werden nicht berücksichtigt