2.Transkriptom RNA Seq 1

Aufgabe 1: Definitionen

Reads: Sequenzierte cDNA-Fragmente, die assembliert werden müssen (also dem Referenzgenom zugeordnet).

Assembly: Bioinformatisches Verfahren, bei dem die reads angeglichen (alignt) und verbunden werden. Dies kann entweder mit Referenzgenom oder ohne (de novo) geschehen. Hierbei werden überlappende reads zu Contiqs und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt.

Contiq: Zusammenhängender Abschnitt einer genomischen Sequenz, die aus überlappenden reads gebildet wird.

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reads, contigs und Scaffold

Coverage: Summe an reads, die ein bestimmtes Nukleotid in der Sequenz beinhalten. Oder anders ausgedrückt: Die Anzahl der reads an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die diese abdecken. Für einen Sequenzabschnit wird es über folgende Formel berechnet:

[math]\displaystyle{ C= \frac{N*L}{G} }[/math]

N - die Anzahl der Reads

L - die durchschnittliche Länge der reads

G - die Länge des Referenzgenoms

library: Pool von DNA-Fragmenten, der aus einer Probe generiert wurde

NGS: Next Generation Sequencing, Sammelbegriff für neuartige Sequenziermethoden, die einen höhere Durchsatz besitzen als die klassische Sangermethode. Dies ist möglich, da die Sequenzierungen parallel durchgeführt werden können.

Scaffold: Einheit von mehreren Contigs, bei denen die Entfernung (Länge in Basenpaaren) zwischen den Contiqs bekannt ist. Die Sequenz zwischen den Contiqs kann dabei unbekannt sein.

RNASeq: Sequenzierung des gesamten Transkriptoms einer Zelle (meist mit NGS Methoden). Dabei wird die RNA zunächst durch reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben.

Aufgabe 2: RNASeq vs. Microarray

a. Vergleich von Microarray und RNASeq

Erläutern Sie die Gemeinsamkeiten und Unterschiede von RNASeq und Microarray.

Vergleich von Microarray und RNASeq

Eigenschaft	Microarray	RNASeq
Kosten	in etwa gleich (Microarrays sind unter Umständen etwas billiger)
Methode	1. Transcriptomics 2. Analyse von RNA 3. Vorgang bis zur Herstellung der cDNA gleich
Prinzip	Hybridisierung	Hochdurchsatz Sequenzierung
Auflösung	einige bis 100 bp	Einzelbase
Hintergrundrauschen	hoch	gering
Dynamischer Bereich	bis 100fach	> 8000fach
Isoformen	teilweise	ja
Benötigte RNA-Menge	hoch	gering

Isoformen: Varianten eines Gens/RNA/Proteins - Bspw. fehlt beim Splicen ein Exon --> andere Funktion

Zum Nachlesen: https://www.chemie.de/lexikon/Isoform.html

Dynamischer Bereich: Bereich, indem die Genexpression unterschiedlicher Proben innerhalb eines Versuches gemessen werden kann. Beim Microarray ist dies beispielsweise limitiert durch das Hintergrundrauschen einerseits und die Signalsättigung andererseits. Deswegen ist der dynamische Bereich hier kleiner als bei RNASeq, die durch viele diskrete, digitale reads die Expression in einem deutlich größeren Bereich quantifizieren kann.

b. Funktionsweise von Microarray und RNASeq

Auf welchem Prinzip beruht die RNA-Sequenzierung, auf welchem das Microarray?
Erklären Sie kurz die Funktionsweise beider Methoden.

Funktionsweise RNASeq:
→ Sequenz-basierte Methode
1. Isolierung der Zellen aus den zu vergleichenden Zelllinien.
2. Isolierung der mRNA.
3. Herstellung der cDNA mit Hilfe der reversen Transkriptase.
4. Fragmentierung der cDNA, Ligation an Adapter und Amplifikation mit PCR.
5. Sequenzierung der Fragmente.
6. Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit dem Referenzgenom, zur Analyse der Expression.

Funktionsweise Microarray:
→ Hybridisierungs-basierte Methode
Schritt 1 bis 3, siehe RNASeq.
4. Markierung der zu vergleichenden cDNAs mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen.
5. Hybridisierung der markierten DNA auf Microarray mit bekannten Transkript-Proben (komplementär).
6. Bei erfolgreicher Hybridisierung entsteht Fluoreszent, die detektiert wird. Durch die unterschiedliche Markierung (Farbe), die Position auf dem Chip und die Stärke der Fluoreszenz kann die Expression der zu vergleichenden Zellen analysiert werden.

Alternativer Erklärungsansatz in Textform:

RNASeq: Zunächst wird eine Library Präparation vorgenommen. Hierber wird die genomische RNA fragmentiert und durch reverse Transkriptase in cDNA umgewandelt. Nach der Ligation von Adaptern werden die neu entstandenen Fragmente mittels PCR amplifiziert. Für die Sequenzierung werden fluoreszenzmarkierte Nucleotide verwendet, welche in jedem Zyklus an die cDNA binden, ein Signal senden, und anschließend wieder entfernt werden. So kann durch Hochdurchsatz-Sequenzierung nach und nach die neu entstandenden Fragmente parallel sequenziert werden. Diese Fragmente müssen dann bioinformatisch prozessiert werden, um die ursprüngliche Sequenz valide zusammensetzen zu können (Alignment).

Microarray: Oft wird vor allem die relative Änderung der Genexpression bekannter Gene untersucht. Hierbei werden bekannte Gene auf einem DNA-Chip als ssDNA (single strained) an eine Trägermembran gebunden. Die zu untersuchende mRNA wird ebenfalls mittel reverser Transkriptase in cDNA umgewandelt (da diese stabiler ist) und an Fluorochrome gebunden. Nachdem die Probe nun auf den fertigen DNA-Chip aufgetragen wird, kann ein Laser die Hybridisierung der Probe mit dem auf dem Chip vorhandenen DNA-Strang nachweisen. Durch die Verwendung unterschiedlicher Fluorochrome kann diese Information noch um weitere Ebenen erweitert werden (Bspw. Vergleich unterschiedlicher mRNA Isolate aus verschiedenen Zellen und/oder Zeitpunkten).

Aufgabe 3: Illumina Sequenzierung

a. Die Anwendung von NGS hat in den letzten Jahren stark zugenommen, Welche möglichen Einsatzgebiete gibt es?

NGS kann für Zwecke wie RNA Sequenzierung (RNAseq, Exome sequencing) und DNA Sequenzierung (Whole genome equencing, methylation sequencing, Protein-DNA Interaktionssequenzierung) verwendet werden.

RNA Seq - Transcriptimics
DNA Seq - Genomics

b. Welche Generationen der Sequenzierung werden unterschieden?

1st Gen.: Sangersequenzierung

2nd Gen.: Illumina, SOLiD, Ion torrent, Pyrosequencing

3rd Gen.: Nanopore, SMRT seq

Vor und Nachteile?

Vor & Nachteile der Generationen

Generationen	Vorteile	Nachteile
1. Generation	Hohe Genauigkeit	Langsam, Teuer
2. Generation	Schnell	Threshold muss überschritten werden
3. Generation	Günstig, vereinfachte Durchführung	Hohe Fehlerate

d. Die Genom-Sequenzierung und die RNA-Sequenzierung kann mit Hilfe von Illumina durchgeführt werden. Was sind die Gemeinsamkeiten und Unterschiede?

DNA & RNA mit Illumina

Generationen	Unterschiede
Omic's Bereich	Genomic	Transcriptomic
Was wird dem Sequenzierer übergeben?	DNA	cDNA aus library
Was wird untersucht?	Sequenz, Aufbau des Genoms, Identifizierung von möglichen Genen	Sequenz, exprimierte Gene, Expressionslevel

e. Dateiformat FastQ

1. Zeile: @ gefolgt von einem Sequenzidentifier,

2. Zeile ist die Sequenz in Buchstabencode

3. Zeile beginnt mit einem + und kann weitere Deskriptoren beinhalten

4. Zeile kodiert die Qualität der Sequenz in Zeile 4 in ASCII

Beispiel:

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

FASTQ: Textbasierte Methode zur Speicherung einer Nukleotidsequenz. Als Zusatzinformation/Metadata wird die Qualität jeder Base in ASCII vermerkt.

Aufgabe 4

a. Wozu wird ein Assembly in Hinblick auf NGS benötigt?

Da die NGS alle auf Shotgunsequenzierung beruhen, werden nur kleine Fragmente sequenziert. Diese Rohdaten sind vollkommen ungeordnet und in keiner Weise miteinander in Bezug. Eine Assembly ist nötig um aus den gewonnen Sequenzierdaten tatsächlich nutzbare Daten über das Genom/Transkriptom zu gewinnen, indem die Sequenzen der ursprünglichen DNA/mRNA wieder zusammengesetzt werden.

b. Welche grundsätzlichen Assemblierungsmethoden gibt es?

De-novo assembly wird genutzt um ohne Template die reads zu verknüpfen. Das Genom ist dabei meist noch unbekannt und deswegen kann es kein Referenzgenom geben, das als Template dienen kann. Dabei werden paired-end (short insert reads) und mate-pair reads (long-insert reads) kombiniert.

Mapping assembly wird genutzt wenn man eine existierende Sequenz (Referenzgenom) hat, an die man die reads anlegen und vergleichen kann (alignen). Dabei werden paired-end Sequenzierungen genutzt.

c. Beschreibe den Ablauf eines Assemblys. Welche Probleme können auftreten?

1. Durch die Sequenzierung werden reads erzeugt.
2. Die reads werden anhand übereinstimmender Sequenzen zu durchgehenden Contiqs zusammengefügt.
3. Diese Contiqs werden zu Scaffolds zusammengefügt, die jedoch noch unbekannte Sequenzabschnitte enthalten können.


Die Menge der reads, die in einen Zusammenhang gebracht werden müssen, können dabei ein Problem darstellen.
Genauso Mutationen (Insertionen, Deletionen) in der Basenabfolge, sowie technische Fehler bei der
Sequenzierung (schlechtes Qualitätslevel der Basen) bzw. beim verwendeten Algorithmus.

d. Was ist ein Alignment und wofür wird es verwendet?

Ein Alignment ist eine Methode zum Vergleich zweier oder mehrerer Nukleotid-, oder Aminosäuresequenzen in linearer Abfolge.
Alignments werden z.B. dazu verwendet reads aneinander auszurichten, um ähnliche/identische Abschnitte zu finden, sodass diese zu Contiqs zusammengefügt werden können.

allgemeine Anwendung: Sequenzvergleiche, phylogenetische Untersuchungen