Microarrays
Microarrays ist eine molekularbiologische Methode, die verwendet wird um Nachweise in biologischen Proben durchzuführen. In Zuge dieser Vorlesung wird unter Microarrays, lediglich die DNA-Chip Microarray-Methode verstanden, bei der der Grad der Genexpression in einer Zelle oder einem Organismus bei einer großen Anzahl an Genen gleichzeitig getestet wird (Transkriptomaktivität).
Funktionsweise
Die Microarray-Technologie nutzt Halbleiter um kurze DNA-Sonden an einem Ende zu binden. Dabei werden unterschiedliche Sequenzen bekannter Gene des zu untersuchenden Organismus auf dem Chip so gebunden, dass verschiedene Spots mit gleichen Sequenzen entstehen (siehe Abbildung 1). Die zu analysierende mRNA-Probe muss für die Methode in cDNA umgeschrieben werden, wobei die Proben unterschiedlich fluoreszent markiert werden. Anschließend wird die cDNA beider Proben gemischt und auf dem DNA-Chip aufgetragen, wobei ähnliche Sequenzen hybridisieren und damit die cDNA auf dem Chip in Clustern mit ähnlichen Sequenzen anheften. Nach der Fixierung werden ungebundene cDNA-Stränge herunter gewaschen. Anschließend wird die Fluoreszenz der Spots gemessen, welche gleichzusetzen mit der Menge gebundener cDNA ist und somit mit der Menge des exprimierten Gens die der Sondensequenz entspricht.
Nachteile
Die Microarray-Technologie tritt heutzutage etwas in den Hintergrund, da die Methode einigen Einschränkungen unterliegt. Zum einen löst das Microarray die Sequenz nicht auf die Einzelbase auf, weshalb Mutanten und Splicevarianten oftmals nicht bestimmt werden können. Dies liegt daran, dass auch Sequenzen hybridisieren, die nicht 100% übereinstimmen. Außerdem beruht die Methode auf optischer Messung, was bedeutet, dass ein gewisses Maß an Hintergrundrauschen unvermeidbar ist und eine Messuntergrenze besteht. Somit kann es vorkommen, dass geringe Mengen an bestimmten Sequenzen nicht nachgewiesen werden können. Diese Methode besitzt zudem eine Messobergrenze, denn wenn alle Sonden in einem Spot hybridisiert haben, kann weitere komplementäre cDNA nicht binden und verfällt wenn sie herunter gewaschen wird. Zudem können nur Proben von Organismen verwendet werden, bei denen die Sequenz bereits bekannt ist.
