2.Transkriptom RNA Seq 1

Aufgabe 1: Definitionen

Reads: Sequenzierte cDNA-Fragmente, die assembliert werden müssen (also dem Referenzgenom zugeordnet).

Assembly: Bioinformatisches Verfahren, bei dem die reads angeglichen (alignt) und verbunden werden. Dies kann entweder mit Referenzgenom oder ohne (de novo) geschehen. Hierbei werden überlappende reads zu Contiqs und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt.

Contiq: Zusammenhängender Abschnitt einer genomischen Sequenz, die aus überlappenden reads gebildet wird.

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reads, contigs und Scaffold

Coverage: Summe an reads, die ein bestimmtes Nukleotid in der Sequenz beinhalten. Oder anders ausgedrückt: Die Anzahl der reads an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die diese abdecken. Für einen Sequenzabschnit wird es über folgende Formel berechnet:

[math]\displaystyle{ C= \frac{N*L}{G} }[/math]

N - die Anzahl der Reads

L - die durchschnittliche Länge der reads

G - die Länge des Referenzgenoms

library: Pool von DNA-Fragmenten, der aus einer Probe generiert wurde

NGS: Next Generation Sequencing, Sammelbegriff für neuartige Sequenziermethoden, die einen höhere Durchsatz besitzen als die klassische Sangermethode. Dies ist möglich, da die Sequenzierungen parallel durchgeführt werden können.

Scaffold: Einheit von mehreren Contigs, bei denen die Entfernung (Länge in Basenpaaren) zwischen den Contiqs bekannt ist. Die Sequenz zwischen den Contiqs kann dabei unbekannt sein.

RNASeq: Sequenzierung des gesamten Transkriptoms einer Zelle (meist mit NGS Methoden). Dabei wird die RNA zunächst durch reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben.

Aufgabe 2: RNASeq vs. Microarray

a. Vergleich von Microarray und RNASeq

Erläutern Sie die Gemeinsamkeiten und Unterschiede von RNASeq und Microarray.

Vergleich von Microarray und RNASeq

Eigenschaft	Microarray	RNASeq
Kosten	in etwa gleich (Microarrays sind unter Umständen etwas billiger)
Methode	1. Transcriptomics 2. Analyse von RNA 3. Vorgang bis zur Herstellung der cDNA gleich
Prinzip	Hybridisierung	Hochdurchsatz Sequenzierung
Auflösung	einige bis 100 bp	Einzelbase
Hintergrundrauschen	hoch	gering
Dynamischer Bereich	bis 100fach	> 8000fach
Isoformen	teilweise	ja
Benötigte RNA-Menge	hoch	gering

b. Funktionsweise von Microarray und RNASeq

Auf welchem Prinzip beruht die RNA-Sequenzierung, auf welchem das Microarray?
Erklären Sie kurz die Funktionsweise beider Methoden.

Funktionsweise RNASeq:
→ Sequenz-basierte Methode
1. Isolierung der Zellen aus den zu vergleichenden Zelllinien.
2. Isolierung der mRNA.
3. Herstellung der cDNA mit Hilfe der reversen Transkriptase.
4. Fragmentierung der cDNA, Ligation an Adapter und Amplifikation mit PCR.
5. Sequenzierung der Fragmente.
6. Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit dem Referenzgenom, zur Analyse der Expression.

Funktionsweise Microarray:
→ Hybridisierungs-basierte Methode
Schritt 1 bis 3, siehe RNASeq.
4. Markierung der zu vergleichenden cDNAs mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen.
5. Hybridisierung der markierten DNA auf Microarray mit bekannten Transkript-Proben (komplementär).
6. Bei erfolgreicher Hybridisierung entsteht Fluoreszent, die detektiert wird. Durch die unterschiedliche Markierung (Farbe), die Position auf dem Chip und die Stärke der Fluoreszenz kann die Expression der zu vergleichenden Zellen analysiert werden.

Aufgabe 3: Illumina Sequenzierung

a. Die Anwendung von NGS hat in den letzten Jahren stark zugenommen, Welche möglichen Einsatzgebiete gibt es?

NGS kann für Zwecke wie RNA Sequenzierung (RNAseq, Exome sequencing) und DNA Sequenzierung (Whole genome equencing, methylation sequencing, Protein-DNA Interaktionssequenzierung) verwendet werden

b. Welche Generationen der Sequenzierung werden unterschieden?

1st Gen.: Sangersequenzierung

2nd Gen.: Illumina, SOLiD, Ion torrent, Pyrosequencing

3rd Gen.: Nanopore, SMRT seq

d. Wie ist das Dateiformat FastQ aufgebaut?

1. Zeile: @ gefolgt von einem Sequenzidentifier,

2. Zeile ist die Sequenz in Buchstabencode

3. Zeile beginnt mit einem + und kann weitere Deskriptoren beinhalten

4. Zeile kodiert die Qualität der Sequenz in Zeile 4 in ASCII

Beispiel:

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

Aufgabe 4

a. Wozu wird ein Assembly in Hinblick auf NGS benötigt?

Da die NGS alle auf Shotgunsequenzierung beruhen, werden nur kleine Fragmente sequenziert. Eine Assembly ist nötig um aus den gewonnen Sequenzierdaten tatsächlich nutzbare Daten über das Genom/Transkriptom zu gewinnen, indem die Sequenzen der ursprünglichen DNA/mRNA wieder zusammengesetzt werden.

b. Welche grundsätzlichen Assemblierungsmethoden gibt es?

de-novo assembly wird genutzt um ohne Template die reads zu verknüpfen.

mapping assembly wird genutzt wenn man eine existierende Sequenz (Referenzgenom) hat, an die man die reads anlegen und vergleichen kann.

c. Beschreibe den Ablauf eines Assemblys. Welche Probleme können auftreten?

1. Durch die Sequenzierung werden reads erzeugt.
2. Die reads werden anhand übereinstimmender Sequenzen zu durchgehenden contiqs zusammengefügt.
3. Diese contiqs werden zu Scaffolds zusammengefügt, die jedoch noch unbekannte Sequenzabschnitte enthalten können.


Die Menge der reads, die in einen Zusammenhang gebracht werden müssen, können dabei ein Problem darstellen.
Genauso Mutationen (Insertionen, Deletionen) in der Basenabfolge, sowie technische Fehler bei der
Sequenzierung (schlechtes Qualitätslevel der Basen) bzw. beim verwendeten Algorithmus.

d. Was ist ein Alignment und wofür wird es verwendet?

Ein Alignment ist eine Methode zum Vergleich zweier oder mehrerer Nukleotid-, oder Aminosäuresequenzen in linearer Abfolge.
Alignments werden z.B. dazu verwendet reads aneinander auszurichten, um ähnliche/identische Abschnitte zu finden, sodass diese zu contiqs zusammengefügt werden können.