2.Transkriptom RNA Seq 1

Aufgabe 1: Definitionen

RNASeq: Sequenzierung des gesamten Transkriptoms einer Zelle durch NGS-Methoden. Dazu muss die mRNA durch Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden.

Reads: Aus der RNA-Seq. erhaltene Fragmente sequenzierter RNA. Diese können anschließend einem Refernezgenom zugeordnet werden.

Contiq: Zusammenhängender Abschnitt einer genomischen Sequenz, die aus überlappenden reads gebildet wird. Zwischen ihnen befinden sich noch Lücken.

Scaffold: Einheit von mehreren Contiqs und Lücken (auch Supercontiqs genannt), die die Reihenfolge, Orientierung und Größe der Lücken zwischen den Contiqs definiert.

Assembly: Bioinformatisches Verfahren, bei dem überlappende reads erst zu Contings und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt werden.

File:PET contig scaffold.png

reads, contigs und Scaffold

Coverage: Die Anzahl der reads an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die diese abdecken. Für einen Sequenzabschnitt wird es über folgende Formel berechnet:

[math]\displaystyle{ C= \frac{N*L}{G} }[/math]

N - die Anzahl der Reads

L - die durchschnittliche Länge der reads

G - die Länge des Referenzgenoms

Library: Pool von DNA-Fragmenten, der aus einer Probe generiert wurde

NGS: Next Generation Sequencing, Sammelbegriff für neuartige Sequenziermethoden, die einen höhere Durchsatz besitzen als die klassische Sangermethode. Dies ist möglich, da die Sequenzierungen parallel durchgeführt werden können.

Aufgabe 2: Illumina Sequenzierung

a. Die Anwendung von NGS hat in den letzten Jahren stark zugenommen, welche möglichen Einsatzgebiete gibt es? Was wird in ihnen untersucht?

• RNA Sequenzierung(Transcriptomics). In Transcriptomics wird die Basenabfolge der RNA, exprimierte Gene und die Expressionslevel unter verschiedenen Bedingungen untersucht.
• DNA Sequenzierung(Genomics). In Genomics wird die Basenabfolge und Aufbau des Genoms, und die Identifizierung von möglichen Genen untersucht.

b. Was ist das FASTQ-Dateiformat und wie ist es aufgebaut?

• Textbasierte Methode zur Speicherung einer Sequenz (DNA/RNA). Dabei wird auch die Qualität der sequenzierten Base jeweils in einem ASCII Symbol vermerkt. Genereller Aufbau:

1. Zeile: @ gefolgt von einem Sequenzidentifier,

2. Zeile ist die Sequenz in Buchstabencode

3. Zeile beginnt mit einem + und kann weitere Deskriptoren beinhalten

4. Zeile kodiert die Qualität der Sequenz in Zeile 4 in ASCII

Beispiel:

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

c. Welche Generationen der Sequenzierung werden unterschieden?

1st Gen.: Sangersequenzierung

2nd Gen.: Illumina, SOLiD, Ion torrent, Pyrosequencing

3rd Gen.: Nanopore, SMRT seq

Vor und Nachteile?

Vor & Nachteile der Generationen

Generationen	Vorteile	Nachteile
1. Generation	Hohe Genauigkeit	Langsam, Teuer
2. Generation	Schnell	Threshold muss überschritten werden
3. Generation	Günstig, vereinfachte Durchführung	Hohe Fehlerate

d. Die Genom-Sequenzierung und die RNA-Sequenzierung kann mit Hilfe von Illumina durchgeführt werden. Was sind die Gemeinsamkeiten und Unterschiede?

DNA & RNA mit Illumina

Generationen	Genom-Sequenzierung	RNA-Sequenzierung
Omic's Bereich	Genomic	Transcriptomic
Was wird dem Sequenzierer übergeben?	DNA	cDNA aus library
Was wird untersucht?	Sequenz, Aufbau des Genoms, Identifizierung von möglichen Genen	Sequenz, exprimierte Gene, Expressionslevel

Aufgabe 3: RNASeq vs. Microarray

a. Vergleich von Microarray und RNASeq

Erläutern Sie die Gemeinsamkeiten und Unterschiede von RNASeq und Microarray.

Vergleich von Microarray und RNASeq

Eigenschaft	Microarray	RNASeq
Kosten	in etwa gleich (Microarrays sind unter Umständen etwas billiger)
Methode	Transcriptomics
	Analyse von RNA
	Vorgang bis zur Herstellung der cDNA gleich
Prinzip	Hybridisierung	Hochdurchsatz Sequenzierung
Auflösung	einige bis 100 bp	Einzelbase
Hintergrundrauschen	hoch	gering
Dynamischer Bereich	bis 100fach	> 8000fach
Isoformen	teilweise	ja
Benötigte RNA-Menge	hoch	gering

Isoformen: Varianten eines Gens/RNA/Proteins - Bspw. fehlt beim Splicen ein Exon --> andere Funktion

Zum Nachlesen: https://www.chemie.de/lexikon/Isoform.html

Dynamischer Bereich: Bereich, indem die Genexpression unterschiedlicher Proben innerhalb eines Versuches gemessen werden kann. Beim Microarray ist dies beispielsweise limitiert durch das Hintergrundrauschen einerseits und die Signalsättigung andererseits. Deswegen ist der dynamische Bereich hier kleiner als bei RNASeq, die durch viele diskrete, digitale reads die Expression in einem deutlich größeren Bereich quantifizieren kann.

b. Funktionsweise von Microarray und RNASeq

Auf welchem Prinzip beruht die RNA-Sequenzierung, auf welchem das Microarray?
Erklären Sie kurz die Funktionsweise beider Methoden.

Funktionsweise RNASeq:
→ Sequenz-basierte Methode
1. Isolierung der Zellen aus den zu vergleichenden Zelllinien.
2. Isolierung der mRNA.
3. Herstellung der cDNA mit Hilfe der reversen Transkriptase.
4. Fragmentierung der cDNA, Ligation an Adapter und Amplifikation mit PCR.
5. Sequenzierung der Fragmente.
6. Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit dem Referenzgenom, zur Analyse der Expression.

Funktionsweise Microarray:
→ Hybridisierungs-basierte Methode
Schritt 1 bis 3, siehe RNASeq.
4. Markierung der zu vergleichenden cDNAs mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen.
5. Hybridisierung der markierten DNA auf Microarray mit bekannten Transkript-Proben (komplementär).
6. Bei erfolgreicher Hybridisierung entsteht Fluoreszent, die detektiert wird. Durch die unterschiedliche Markierung (Farbe), die Position auf dem Chip und die Stärke der Fluoreszenz kann die Expression der zu vergleichenden Zellen analysiert werden.

Alternativer Erklärungsansatz in Textform:

RNASeq: Zunächst wird eine Library Präparation vorgenommen. Hierber wird die genomische RNA fragmentiert und durch reverse Transkriptase in cDNA umgewandelt. Nach der Ligation von Adaptern werden die neu entstandenen Fragmente mittels PCR amplifiziert. Für die Sequenzierung werden fluoreszenzmarkierte Nucleotide verwendet, welche in jedem Zyklus an die cDNA binden, ein Signal senden, und anschließend wieder entfernt werden. So kann durch Hochdurchsatz-Sequenzierung nach und nach die neu entstandenden Fragmente parallel sequenziert werden. Diese Fragmente müssen dann bioinformatisch prozessiert werden, um die ursprüngliche Sequenz valide zusammensetzen zu können (Alignment).

Microarray: Oft wird vor allem die relative Änderung der Genexpression bekannter Gene untersucht. Hierbei werden bekannte Gene auf einem DNA-Chip als ssDNA (single strained) an eine Trägermembran gebunden. Die zu untersuchende mRNA wird ebenfalls mittel reverser Transkriptase in cDNA umgewandelt (da diese stabiler ist) und an Fluorochrome gebunden. Nachdem die Probe nun auf den fertigen DNA-Chip aufgetragen wird, kann ein Laser die Hybridisierung der Probe mit dem auf dem Chip vorhandenen DNA-Strang nachweisen. Durch die Verwendung unterschiedlicher Fluorochrome kann diese Information noch um weitere Ebenen erweitert werden (Bspw. Vergleich unterschiedlicher mRNA Isolate aus verschiedenen Zellen und/oder Zeitpunkten).

Aufgabe 4: Alignement und Assembly

a. Wozu wird ein Assembly in Hinblick auf NGS benötigt?

Da die NGS alle auf Shotgunsequenzierung beruhen, werden nur kleine Fragmente sequenziert. Diese Rohdaten sind vollkommen ungeordnet und in keiner Weise miteinander in Bezug. Eine Assembly ist nötig um aus den gewonnen Sequenzierdaten tatsächlich nutzbare Daten über das Genom/Transkriptom zu gewinnen. Durch das Assembly wird die eigentliche Sequenz aus den erhaltenen reads rekonstruiert und zusammengesetzt.

b. Welche grundsätzlichen Assemblierungsmethoden gibt es?

• De-novo:
  
  • kein Template vorhanden, da Genom meist noch unbekannt ist. Deswegen kein Referenzgenom, das als Template dienen kann.
  • dabei werden paired-end (short insert reads) und mate-pair reads (long-insert reads) kombiniert. Die Assemblierung läuft über Graphen (z.B. de Bruijn-Graph/ Eulersche Pfade).

• Mithilfe eines Referenzgenoms:
  
  • existierendes Referenzgenom
  • Assemblierung der Probe an ein bekanntes Referenzgenom mithilfe von Alignments
  • dabei werden paired-end Sequenzierungen genutzt

c. Beschreibe den Ablauf eines Assemblys. Welche Probleme können auftreten?

1. Durch die Sequenzierung werden reads erzeugt.
2. Aus der Sequenzierung erhaltene reads werden durch überlappende Bereiche lückenlos zu Contiqs zusammengesetzt.
3. Die Orientierung der Contiqs wird bestimmt und zu Scaffolds zusammengesetzt; durch die Art der Sequenzierung, z.B. paired-end Sequenzierung, ergeben sich charakteristische Längen zwischen den reads (Lücken), die zusammen mit den Contiqs die Scaffolds bilden.


Probleme:

• Geringe Abdeckung durch reads
• Sequenzlänge der reads ist zu kurz
• Fehlende durchgängige Orientierung der Contiqs
• Schlechte read-Qualität, fehlerhafte read Paare

d. Was ist ein Alignment und wofür wird es verwendet?

• Alignment = optimales „Aneinander ausrichten“ von Sequenzen, sodass z.B. reads aus einer Sequen- zierung an ein Referenzgenom ausgerichtet werden können
• Anwendung: Sequenzvergleiche, phylogenetische Untersuchungen

Allgemeine Anwendung: Sequenzvergleiche, phylogenetische Untersuchungen