RNAseq: Difference between revisions
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Im zweiten Schritt wird die cDNA mit Realtime PCR amplifiziert, damit man eine bekannt Menge an cDNA in den Sequencer geben kann. | |||
Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit Next-Generation-Sequencing Methoden (z.B. [[Illumina]]) sequenziert. Die Fragmentsequenzen (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten. | Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit Next-Generation-Sequencing Methoden (z.B. [[Illumina]]) sequenziert. Die Fragmentsequenzen (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten. | ||
Revision as of 19:10, 8 May 2019
RNAseq ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle ermittelt.
Durchführung
Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen Umgegungen natürlich vorkommen und die RNA abbauen können.
Im zweiten Schritt wird die cDNA mit Realtime PCR amplifiziert, damit man eine bekannt Menge an cDNA in den Sequencer geben kann.
Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit Next-Generation-Sequencing Methoden (z.B. Illumina) sequenziert. Die Fragmentsequenzen (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden (Assembly) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten.
Vorteile der RNAseq
Vorteilhaft an der RNA-seq gegenüber Microarray ist, dass die Auflösung auf die Base genau ist. Da man die genaue Sequenz besitzt kann man deshalb einfach zwischen verschieden Mutanten und Splicevarianten unterscheiden. Außerdem besitzt diese Methode viel weniger Hintergrundrauschen und hat keine Messobergrenze, das heisst auch besonders hohe Expressionslevel können noch akkurat erfasst werden. Außerdem ist die benötigte RNA-Menge weitaus weniger im Vergleich zu Microarrays.
