RNAseq: Difference between revisions
(Created page with "RNAseq ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle ermittelt. == Durchführung == Nach der Isolie...") |
No edit summary |
||
| (One intermediate revision by one other user not shown) | |||
| Line 1: | Line 1: | ||
RNA sequencing ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle durch Next-Generation Sequencing (NGS) ermittelt. | |||
== Durchführung == | == Durchführung == | ||
Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen | Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen Umgebungen natürlich vorkommen und die RNA abbauen können. | ||
Im zweiten Schritt wird die cDNA mit Realtime PCR amplifiziert, damit eine bekannt Menge an cDNA in den Sequencer gegeben werden kann. | |||
Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit NGS-Methoden (z.B. [[2_Transkriptom_RNA_Seq_1#Next_Generation_Sequencing_.28NGS.29|Illumina]]) sequenziert. Die fragmentierten Sequenzen (''reads'') müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[2_Transkriptom_RNA_Seq_1#Assemblierung_der_reads|Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten. Unter anderem, können die ''reads'' durch das Zuordnen an ein Referenzgenom zusammengefügt werden ([[3_Alignments|Alignment]]). | |||
Vorteilhaft an der RNA-seq gegenüber [[Microarrays|Microarray]] ist, dass die Auflösung auf die Base genau ist. Da man die genaue Sequenz besitzt kann man deshalb einfach zwischen verschieden Mutanten und Splicevarianten unterscheiden. Außerdem besitzt diese Methode viel weniger Hintergrundrauschen und hat keine Messobergrenze, das heisst auch besonders hohe Expressionslevel können noch akkurat erfasst werden. Außerdem ist die benötigte RNA-Menge weitaus weniger im Vergleich zu Microarrays. | == Vorteile == | ||
Vorteilhaft an der RNA-seq gegenüber [[Microarrays|Microarray]] ist, dass die Auflösung auf die Base genau ist. Da man die genaue Sequenz besitzt kann man deshalb einfach zwischen verschieden Mutanten und Splicevarianten unterscheiden. Außerdem besitzt diese Methode viel weniger Hintergrundrauschen und hat keine Messobergrenze, das heisst auch besonders hohe Expressionslevel können noch akkurat erfasst werden. Außerdem ist die benötigte RNA-Menge weitaus weniger im Vergleich zu Microarrays. Auch Proben von unbekannten Organismen können sequenziert werden. | |||
Latest revision as of 17:32, 28 January 2021
RNA sequencing ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle durch Next-Generation Sequencing (NGS) ermittelt.
Durchführung
Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen Umgebungen natürlich vorkommen und die RNA abbauen können.
Im zweiten Schritt wird die cDNA mit Realtime PCR amplifiziert, damit eine bekannt Menge an cDNA in den Sequencer gegeben werden kann.
Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit NGS-Methoden (z.B. Illumina) sequenziert. Die fragmentierten Sequenzen (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden (Assembly) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten. Unter anderem, können die reads durch das Zuordnen an ein Referenzgenom zusammengefügt werden (Alignment).
Vorteile
Vorteilhaft an der RNA-seq gegenüber Microarray ist, dass die Auflösung auf die Base genau ist. Da man die genaue Sequenz besitzt kann man deshalb einfach zwischen verschieden Mutanten und Splicevarianten unterscheiden. Außerdem besitzt diese Methode viel weniger Hintergrundrauschen und hat keine Messobergrenze, das heisst auch besonders hohe Expressionslevel können noch akkurat erfasst werden. Außerdem ist die benötigte RNA-Menge weitaus weniger im Vergleich zu Microarrays. Auch Proben von unbekannten Organismen können sequenziert werden.
