7 Multiples Testen

Multiples Testen

In der Tabelle sind die Werte für 4 Gene dargestellt. Insgesamt wurden 5000 Gene untersucht.

• K1-3 stellen die Kontrollen dar.
  
• T1-3 die getesteten mit dem NAT8L knock-out.
• Der fold change stellt das Verhältnis von knock-out und Kontrolle dar → Hoch oder runter regulierte Gene.
• Die Ergebnisse sind nicht gut vergleichbar, da sie teilweise eine große Streuung zeigen.

Gen	K1	K2	K3	T1	T2	T3	[math]\displaystyle{ \overline{X} }[/math] Kontrolle	[math]\displaystyle{ \overline{X} }[/math] -NAT8L	fold change	p-Wert	pi-Wert
NAT8L	340	348	350	2	0	4	346	2	0,0058	1 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	0,05
LDH	57	68	34	112	128	105	53	115	2,17	0,0043	21,5
IDH	215	110	55	158	357	415	126,7	310	2,44	0,129	645
HIF1[math]\displaystyle{ \alpha }[/math]	57	58	57	564	570	565	57,3	566,3	9,88	7,2 x [math]\displaystyle{ 10^{-6} }[/math]	0,036

t-Test

Der t-Test wird verwendet, um zu bestimmen, ob die Mittelwerte zweier Stichproben sich signifikant voneinander unterscheiden. Dafür wird die Nullhypothese H0 getestet, sie sagt aus, dass Stichprobe und Kontrolle sich nicht signifikant unterscheiden. In diesem Fall also

[math]\displaystyle{ H_0: \overline{X} Kontrolle = \overline{X}-NAT8L }[/math]

Die Gegenhypothese H1 sagt aus, dass sich die Ergebnisse signifikant unterscheiden, also

[math]\displaystyle{ H_1: \overline{X} Kontrolle \ne \overline{X}-NAT8L }[/math]

Mit Hilfe des t-Tests wird bestimmt, ob die Nullhypothese zutrifft, oder ob sie verworfen wird und die Gegenhypothese angenommen wird. Die Formel zur Berechnung der t-Werte entspricht:

[math]\displaystyle{ t = \frac{\overline{X}_{1} - \overline{X}_{2} }{s_{x} \cdot \surd \frac{1}{n_{1}} + \frac{1}{n_{2}}} }[/math]

Parameter:

• [math]\displaystyle{ \overline{X}_1 }[/math] = Mittelwert Stichprobe 1
  
• [math]\displaystyle{ \overline{X}_2 }[/math] = Mittelwert Stichprobe 2
  
• [math]\displaystyle{ s_x }[/math] = Standardabweichung
• n = Größe der Stichprobe
  

Nach der Berechnung der t- Werte, Standardabweichung und den Freiheitsgraden werden die t-Werte in die t-Verteilung eingesetzt. Daraus kann mit Hilfe des p-Werts beurteilt werden, ob die Nullhypotese angenommen, oder verworfen wird.

P-Wert

Das geforderte Signifikanzniveau ist P≤0,05, nur dann werden die Ergebnisse als signifikant angesehen.

Problem:
In diesem Fall wurden 5000 Genexpressionen verglichen (n=5000). Statistisch gesehen werden ca. 250 Gene durch Zufall einen p-Wert von [math]\displaystyle{ \leq }[/math] 0,05 haben. → [math]\displaystyle{ \alpha }[/math]-Fehler (Fehler 1. Art)

• Fehler 1. Art: Die Nullhypothese wird verworfen, obwohl sie eigentlich zutrifft.

Lösung 1: Bonferroni-Korrektur

• Für jeden p-Wert wird ein neuer p-Wert berechnet.
• Bestimmter p-Wert wird mit Größe der Stichprobe multipliziert.

[math]\displaystyle{ P_i* = P_i \cdot n }[/math]

Parameter:

• [math]\displaystyle{ P_i = }[/math] Bestimmter p-Wert für Gen 'i'
  
• [math]\displaystyle{ P_i* = }[/math] Korrigierter P-Wert für Gen 'i'
  
• n = Größe der Stichprobe

Gen	[math]\displaystyle{ P_i }[/math]	[math]\displaystyle{ P_i* = }[/math]
NAT8L	1,00 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	0,05 → Signifikant
LDH	0,0043	21,5
IDH	0,129	645
HIF1[math]\displaystyle{ \alpha }[/math]	7,2 x [math]\displaystyle{ 10^{-6} }[/math]	0,036 → Signifikant

Vorteile	Nachteile
- Statistisch sehr sicher	- Sehr streng
	- Produziert viele falsch negative Ergebnisse

Lösung 2: Benjamini-Hochberg-Prozedur

• Eine Alternative zu Bonferroni, die nicht so streng ist.
  
• Es wird ein gewisser Prozentsatz bestimmt, der auch falsch akzeptiert wird.
  
• Q als Bezeichnung für die False Discovery Rate (FDR).
  
  

1. Sortiere alle p-Werte aufsteigend.
   
2. Weise jedem p-Wert einen Rang 'i' zu.
   
3. Berechne für jeden p-Wert den Benjamini-Hochberg kritischen Wert.
   
4. Vergleiche original p-Wert mit kritischem BH und finde den größten p-Wert ([math]\displaystyle{ p_k }[/math]), der kleiner, als der der kritische BH ist.
5. Lehne alle Nullhypothesen [math]\displaystyle{ H_t }[/math] für t= 1 bis k ab.

Benjamini-Hochberg kritischer Wert (BH) = [math]\displaystyle{ \frac{i}{n} \cdot Q }[/math]
Parameter:
n = Anzahl der Tests
i = Rang
Q = False Discovery Rate

Beispiel:

Gen	p-Wert	Rang 'i'	BH	p < BH	Signifikant für Q = 5 %
HIF1[math]\displaystyle{ \alpha }[/math]	7,2 x [math]\displaystyle{ 10^{-6} }[/math]	1	1 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	wahr	ja
MDH	2,5 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	2	2 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	falsch	ja
HK	2,8 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	3	3 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	wahr	→ ja
LDH	0,0043	4	4 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	falsch	nein
PDH	0,02	5	5 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	falsch	nein
IDH	0,129	6	6 x [math]\displaystyle{ 10^{-5} }[/math]	falsch	nein
...4994 weitere Gene	...	...	...	...	...