5.Transkriptom RNA Seq 2

Der Übungszettel war am 16.05.2019 abzugeben.

Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein

a. Was versteht man unter mRNA?

Messenger-RNA, auch mRNA ist ein einzelsträngiges Transkript einer genomischen Sequenz. Wird in Eukaryoten noch einmal prozessiert und gespleißt. Zu beachten ist, dass die mRNA aus Nukleotide Ribose als Zucker besitzen und nicht Desoxyribose, wie die DNA.

b. Wie könnte man vorgehen, um mRNA anzureichern?

Bei dieser Frage gibt es mehrere Lösungen, eine Antwort könnte so aussehen:

Man lysiert eine Zellkultur, isoliert die mRNA mit der Methode der eigenen Wahl (man könnte zum Beispiel die RNA an magnetische microbeads mit Poly-A-Tag binden lassen und dann eine Magnetfilterung durchführen). Anschließend kann man die Probe anreichern indem man die rRNA abbaut.

 Die mRNA kann man dann

aufkonzentrieren indem man in einer Vakuumkammer Wasser der Lösung verdampfen lässt und somit die Konzentration an mRNA erhöht.

c. Ist es möglich, mRNA direkt zu sequenzieren? Wie ist das Vorgehen?

Ja, mittlerweile kann man mRNA auch mehr oder weniger direkt sequenzieren. Dabei wird auf das sequencing by synthesis zurückgegriffen. Hierbei verwendet man einzelne mRNA-Moleküle an denen Schrittweise fluoreszent markierte Nukleotidanaloge von einer speziellen Polymerase angebaut werden. Dabei kann dann die Sequenz über die Lichtemissionen über Zeit bestimmt werden.

d. Wie werden einzelne „reads“ den dazugehörigen Genen zugeordnet?

Reads werden mithilfe der Burrows-Wheeler-Transformation an das dazugehörige Genom angelegt. Dazu wird die Burrows-Wheeler-Transformation durchgeführt und der read wird als Sequenz in der BWT gesucht (siehe Hausaufgabe 4 Aufgabe 1d)