5 Transkriptom RNA Seq 2

RNAseq

RNA sequencing ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle durch Next-Generation Sequencing (NGS) ermittelt.

1. Isolierung von mRNA

• nur 1-2% der totalen RNA ist mRNA
• 90% rRNA
• weil wir nur die mRNA isolieren wollen, müssen wir diese von der restlichen RNA trennen
• das ist entweder durch die sogennante poly(A) Anreicherung möglich, dabeimacht man sich die besondere Eigenschaft der mRNA zu nutze
• diese besitzt im Gegensatz zu anderen RNA Spezies einen polyA-Schwanz, immobilisiert man auf der Matrix einer Chromatofraphiesäule polyT-Seqeunezen, kann die mRNA komplementär an diese binden und kann so hufgereinigt werden
• die zweite Möglichkeit ist der spezifische Abbau von rRNA
• diese Vorgehensweise gewinnt vor allem bei Prokaryotischer mRNA an Bedeutung, bei der es keinen polyA-Schwanz gibt

2. cDNA Synthese und Library Präparation

• Information über kodierenden Strang kann durch 2-stufige cDNA Synthese und dUTP Nukleotiden konserviert werden.

3' UUUUU-AAAA 5'     mRNA mit polyA tail
↓Reverse Transcriptase
3' AAAAA-TTTT 5'    cDNA Strang wird mit Reverse Transkriptase synthetisiert
↓Synthese des komplementären cDNA Strangs durch Polymerase
3' AAAAA-TTTT 5'
5' UUUUU-AAAA 3'    cDNA Doppelstrang, dUTPs werden hinzugegeben keine dTTPs, dadurch Markierung des non-coding Strangs
A-A   A-A   A-TTT
U-U   U-U  U-AAA    library preparation und Adapter Ligierung

• Abbau des non Coding Stranges durch durch URacil-DNA-Glykosylase
• baut spezifisch den non coding Strang ab, weil dieser als einziger Uracil besitzt
• d.h. alle zum cDNA-Originalstrang komplementären Stränge werden abgebaut
• durch die Adapter bleibt die Topologie erhalten
• es folgt die Amplifikation mittels PCR

3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing

• Sequenziertiefe bestimmt die Empfindlichkeit und die Genauigkeit
• 5 Millionen reads ausreichend für mittel-hoch exprimierte Gene
• 100 Millionen reads für schwach exprimierte Gene
• wichtig: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede

	Replikate pro Gruppe
fold change	3	5	10
1,25	17%	25%	44%
1,5	43%	64%	91%
2	87%	98%	100%

4. Datenanalyse

Präsprozessierung der Rohdaten:
⇒Filtern von Basen mit geringer Qualität
⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen
⇒ Programme: FASTQC, NGSQC, Trimmomatic

5. Read Alignment