5 Transkriptom RNA Seq 2

RNAseq

RNA sequencing ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle durch Next-Generation Sequencing (NGS) ermittelt.

1. Isolierung von mRNA

• nur 1-2% der totalen RNA ist mRNA
• 90% rRNA
• weil wir nur die mRNA isolieren wollen, müssen wir diese von der restlichen RNA trennen
• das ist entweder durch die sogennante poly(A) Anreicherung möglich, dabeimacht man sich die besondere Eigenschaft der mRNA zu nutze
• diese besitzt im Gegensatz zu anderen RNA Spezies einen polyA-Schwanz, immobilisiert man auf der Matrix einer Chromatofraphiesäule polyT-Seqeunezen, kann die mRNA komplementär an diese binden und kann so hufgereinigt werden
• die zweite Möglichkeit ist der spezifische Abbau von rRNA
• diese Vorgehensweise gewinnt vor allem bei Prokaryotischer mRNA an Bedeutung, bei der es keinen polyA-Schwanz gibt

2. cDNA Synthese und Library Präparation

• Information über kodierenden Strang kann durch 2-stufige cDNA Synthese und dUTP Nukleotiden konserviert werden.

• Abbau des non-coding Stranges durch durch Uracil-DNA-Glykosylase
• baut spezifisch den non-coding Strang ab, weil dieser als einziger Uracil besitzt
• d.h. alle zum cDNA-Originalstrang komplementären Stränge werden abgebaut
• durch die Adapter bleibt die Topologie erhalten
• es folgt die Amplifikation mittels PCR

3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing

• Sequenziertiefe bestimmt die Empfindlichkeit und die Genauigkeit
• 5 Millionen reads ausreichend für mittel-hoch exprimierte Gene
• 100 Millionen reads für schwach exprimierte Gene
• wichtig: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede

	Replikate pro Gruppe
fold change	3	5	10
1,25	17%	25%	44%
1,5	43%	64%	91%
2	87%	98%	100%

• die Tabelle stellt die Wahrscheinlichkeit dar, einen bestimmten fold change bei einer bestimmten Anzahl an Repliken zu delektieren bzw. statistisch signifikant zu finden

4. Datenanalyse

Präsprozessierung der Rohdaten:
⇒Filtern von Basen mit geringer Sequenzierqualität
⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen
⇒ Programme: FASTQC, NGSQC, Trimmomatic

5. Read Alignment

SAM und BAM Format

• Enthält Informationen über die Sequenz-reads nach dem Alignment an ein Referenzgenom.
• SAM= Sequence Alignment/Map
• BAM= Binary Alignment/Map
• SAM ist ein textbasiertes Dateiformat und BAM ein binäres Dateiformat.