2 Transkriptom RNA Seq 1

Biologische Fragestellung

Da NAT8L in euren Prostatakarzinomzellen erhöht exprimiert ist, habt ihr euch entschlossen die Genexpression durch RNAi (RNA Interferenz) zu silencen.

Experiment

• Aus zwei Tumorzellkulturen wird die mRNA extrahiert
• mit Hilfe der reversen Transkriptase wird cDNA transkribiert
• cDNA wird sequenziert
• Sequenzunterschiede können analysiert werden
  

Sanger Methode

Als Wiederholung:

400px][https://de.wikipedia.org/wiki/DNA-Sequenzierung#Didesoxymethode_nach_Sanger

Next Generation Sequencing (NGS)

Illumina Sequencing (2nd Generation Sequencing)

File:Cluster Generation.png

1. Nach der Fragmentierung und Legierung der Adapter-Molekülen, heften sich die Fragmente an komplementäre Adaptersequenzen in der "flow cell". 2. Die DNA biegt sich um den zweiten Adapter zu hybridisieren. 3-4. Die Polymerase synthetisiert den komplementären Strang. 5. Die Stränge denaturieren und bilden neue Brücken. Das Resultat sind Cluster der DNA-Stränge.

Ergebnis der Illumina Sequenzierung:

• Länge der reads 50-600bp
• Fehlerrate ca. 0,1%
• humanes Genom kann 30x am Tag sequenziert werden
• Daten werden in FASTQ Format geliefert

FASTQ

Eine FASTQ-Datei ist folgendermaßen aufgebaut:

@ Identifier  # Sequenz identifier
GATCTT        # Sequenz
+             # optionale Beschreibung
!'CC'*+*!?    # Qualität jedes Nukleotids (Zahlenwert repräsentiert durch ASCII Tabelle)

Problem

Viele kurze reads, die in einen Zusammenhang gebracht werden müssen!

Sequenzabdeckung

G: Länge der Genomsequenz
N: Anzahl der reads
L: durchschnittliche Länge der reads
C: Coverage (Abdeckung)

[math]\displaystyle{ C= \frac{N*L}{G} }[/math]

Lander-Waterman-Modell

Mathematisches Modell zur Errechnung, durch Sequenzierung, nicht abgedeckter Basenpaare.

P_{[nicht abgedecktes Bp]} = e^-c

Beispiele:
C=10 → 1 Gap in 22000 Bp

C=22 → 1 Gap in 3,6*10⁹ Bp

C=30 → So tief, dass quasi alles überdeckt wird

Assemblierung der reads

Aus der RNA-Seq erhaltene Fragmente sequenzierter RNA. Diese werden anschließend dem Referenzgenom (Template) zugeordnet werden.

-A

-C

-C

-T

-G

-A

-C

T

-A

-G

-C

-T

-G

-A

-T

-C

-A

-A

-G

-G

-

-

Template

-G

-A

-T

-C

-A

-A

-A

-G

-C

-T

-G

-A

-A

-C

G

-A

-G

-C

-T

-

-

Punktmutation

-G

-A

-_

-C

-A

-A

-G

-G

-

-

Deletion