1. Datenbanken

Aufgabe1: RNASeq vs. Microarray

a. Vergleich von Microarray und RNASeq

Erläutern Sie die Gemeinsamkeiten und Unterschiede von RNASeq und Microarray.

Vergleich von Microarray und RNASeq

Eigenschaft	Microarray	RNASeq
Kosten	in etwa gleich
Methode	Transcriptomics, Analyse von RNA Vorgang bis zur Herstellung der cDNA gleich
Prinzip	Hybridisierung	Hochdurchsatz Sequenzierung
Auflösung	einige bis 100 bp	Einzelbase
Hintergrundrauschen	hoch	gering
Dynamischer Bereich	bis 100fach	> 8000fach
Isoformen	teilweise	ja
Benötigte RNA-Menge	hoch	gering

b. Funktionsweise von Microarray und RNASeq

Auf welchem Prinzip beruht die RNA-Sequenzierung, auf welchem das Microarray?
Erklären Sie kurz die Funktionsweise beider Methoden.

Funktionsweise RNASeq:
→ Sequenz-basierte Methode
1. Isolierung der Zellen aus den zu vergleichenden Zelllinien.
2. Isolierung der mRNA.
3. Herstellung der cDNA mit Hilfe der reversen Transkriptase.
4. Fragmentierung der cDNA, Ligation an Adapter und Amplifikation mit PCR.
5. Sequenzierung der Fragmente.
6. Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit dem Referenzgenom, zur Analyse der Expression.

Funktionsweise Microarray:
→ Hybridisierungs-basierte Methode
Schritt 1 bis 3, siehe RNASeq.
4. Markierung der zu vergleichenden cDNAs mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen.
5. Hybridisierung der markierten DNA auf Microarray mit bekannten Transkript-Proben (komplementär).
6. Bei erfolgreicher Hybridisierung entsteht Fluoreszent, die detektiert wird. Durch die unterschiedliche Markierung (Farbe), die Position auf dem Chip und die Stärke der Fluoreszenz kann die Expression der zu vergleichenden Zellen analysiert werden.

Aufgabe 2: Datenbanken

Nutzen Sie für die Lösung dieser Aufgabe die Datenbank Expression Atlas des EBI.

a. Recherche Log₂-fold change

Suchen Sie die Analyse der NLRC4 Inflammasom Mutation im Menschen. Geben Sie die 3 Gene an, welche mit einem Log₂-fold change von über 4 vor der Anakinra Behandlung im Vergleich zum normalen Phänotyp hochreguliert sind. Geben Sie außerdem die dazugehörigen, angepassten p-Werte an.

Log₂-fold change von über 4 bei der Analyse der NLRC4 Inflammasom Mutation im Menschen

Gen	Log2-fold change	p-value
UNC93B3	4,9	1,2097*10-12
C4BPA	4,3	1,1289*10-19
MTRNR2L8	5,7	1,6487*10-42

Lösungsweg:

1. Im Expression Atlas den Reiter 'Browse Experiments' öffnen.
2. Suche mit den gegebenen Informationen durchführen, das Ergebnis ist dann das Experiment mit dem Titel 'An activating NLRC4 inflammasome mutation causes autoinflammation with recurrent macrophage activation syndrome'.
3. Die Ergebnisse dieses Experimentes liefern auch einen Vergleich der Genexpressionen von 'NLRC4-Macrophage Activation Syndrome; prior to anakinra treatment' vs. 'normal'.

b. Expressionslevel des Gens LDHA

Geben Sie die Expressionslevel (in TPM) des Gens LDHA aus dem Experiment „Expression data from 7 Human Melanomas“ an.

Expressionslevel des Gens LDHA aus dem Experiment 'Expression data from 7 Human Melanomas'

Zelllinie	Expressionslevel [TPM]
A2058	1085
A375	729
C32	1192
Malme3M	295
SKMEL5	568
SKMEL28	1677
WM2664	789

1. In Experiments in Expression Atlas nach dem Experiment 'Expression data from 7 Human Melanomas' suchen.
2. In dem Experiment nach den Ergebnissen des Gens 'LDHA' suchen.

c. Datenbankrecherche zu 'HER2 Positive Breast Carcinoma'

Bei der Untersuchung von 17 Brustkrebsproben (HER2 Positive Breast Carcinoma) aus drei verschiedenen Subtypen zeigte sich im Vergleich zu normalen menschlichen Brustzellen welcher Log2-fold change des Gens LDHA? Geben Sie grob Ihr Vorgehen wieder, mit dem Sie das Ergebnis in der Datenbank gefunden haben.

1. Expression Atlas – Home, Suche
2. Gene/Gene properties → ‚HER2‘ & ‚LDHA‘
   Species → ‚Homo sapiens‘
   Biological conditions → ‚positive breast carcinoma‘
3. Im Suchergebnis den Reiter ‚differential expression‘ öffnen
4. Ergebnis:
   • Name des Experiments: ‚RNA-Seq. Of 17 breast tumor samples of three different subtypes and normal human breast organoids samples‘
   • Vergleich: ‚HER2 Positive Breast Carcinoma, breast carcinoma‘ vs. ‚normal‘
   • Log₂-fold change des Gens LDHA: - 2,2 (p-value: 8,1727*10^-7)

d. ENSG Nummer LDHA & Expression im Herzen

Welche Ensembl gene (ENSG) Nummer hat LDHA? Welches Expressionslevel weist LDHA laut der Human Proteome Map im Herzen von Menschen im adulten bzw. fetalen Stadium auf? In welchem Stadium ist LDHA höher exprimiert?
LDHA → ENSG00000134333
Expressionslevel von LDHA im Herzen (Human Proteome Map)

• adult: 0,0004281 (low)
• fetal: 0,0014373 (medium)
  

Im fetalen Stadium ist LDHA höher exprimiert, als im adulten Stadium.