5 Transkriptom RNA Seq 2: Difference between revisions
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⇒ Wichtig: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede | ⇒ Wichtig: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede | ||
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Revision as of 00:56, 16 May 2019
Auf dieser Seite sind die Themen zusammengeführt, die in Vorlesung 5 am 09.05.2019 behandelt wurden.
RNAseq
1. Isolierung von mRNA
- nur 1-2% der totalen RNA ist mRNA
- 90% rRNA
- poly(A) Anreicherung
- Abbau von rRNA
2. cDNA Synthese und Library Präparation
- Information über kodierenden Strang kann durch 2-stufige cDNA Synthese und dUTP Nukleotiden konserviert werden.
| A | U | G | U | C | G | A | mRNA | |
| T | A | C | A | G | C | U | 1. cDNA Strang | |
| T | A | C | A | G | C | U | ||
| A | U | G | U | C | G | A | 2. cDNA Strang mit dUTPs statt dTTPs |
⇒ Library Präparation, Adapter Legierung
⇒ Abbau des 2. Strangs durch Uracil-DNA Glykosylase
→ PCR/ Amplifizierung / Sequenzierung
3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing
⇒ Sequenziertiefe bestimmt die Empfindlichkeit und die Genauigkeit
⇒ 5 Millionen reads ausreichend für mittel-hoch exprimierte Gene
⇒ 100 Millionen reads für schwach exprimierte Gene
⇒ Wichtig: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede
| Replikate pro Gruppe | |||
| fold change | 3 | 5 | 10 |
| 1,25 | 17% | 25% | 44% |
| 1,5 | 43% | 64% | 91% |
| 2 | 87% | 98% | 100% |
