6 Normalisierungen

Normalisierungen

Unter Normalisierung versteht man in der Biologie die Verringerung von Verzerrungen innerhalb eines Datensatzes. Systematische Verzerrungen sind z.B. verschiedene Durchführungsrunden, unterschiedliche Bedingungen, Laborausstattung, Experimentatoren ect. Auch die heterologe Geneigenschaften können zu unterschiedlichen Ergebnissen bei eigentlich gleicher Genexpression führen, wie z.B. Genlänge. Normalisierungen der RNASeq-Daten sind deshalb notwendig, um diese vergleichen. zu können und die tatsächliche Genexpression quantifizieren zu können.

RPKM

RPKM steht für 'Reads per kilobase of transcript per Million mapped reads' und ist eine Normalisierungsmethode für Expressionsstärken.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ RPKM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i} \cdot N} *10^6 }[/math]	ci = Anzahl an ausrichtbaren reads für ein Transkript 'i' Li = Länge des Transkripts/Gens 'i' in kbp N = Gesamtanzahl an ausrichtbaren reads in Millionen

[math]\displaystyle{ \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}} }[/math] → Normalisierung der Genlänge
[math]\displaystyle{ L_\text{i} \cdot N }[/math] → Normalisierung der Sequenziertiefe Je höher der RPKM-Wert ist, desto höher ist die Genexpression.
RPKM-Werte können gut zum Vergleich der Genexpressionen innerhalb einer Probe genutzt werden, jedoch sind sie nicht dafür geeignet mehrere Experimente bzw. Proben miteinander zu vergleichen.

Beispiel:

[math]\displaystyle{ N=6*10^6 reads }[/math]

• [math]\displaystyle{ RPKM (A) = \frac{12}{0,6 kbp \cdot 6} * 10^6 = 3,33 \cdot 10^{6} }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ RPKM (B) = \frac{24}{1,1 kbp \cdot 6} * 10^6 = 3,64 \cdot 10^{6} }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ RPKM (C) = \frac{11}{1,4 kbp \cdot 6} * 10^6= 1,31 \cdot 10^{6} }[/math]
  
  

Durch die Normalisierung der Expressionsstärken können diese nun miteinander vergleichen werden.In diesem Beispiel wird Gen B am stärksten exprimiert und Gen C am schwächsten.

TPM

TPM steht für 'Transcripts per Million' und ist eine Normalisierungsmethode für Expressionsstärken.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ TPM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}} \cdot \dfrac {1}{\sum_\text{n} \dfrac {c_\text{n}}{L_\text{n}}} \cdot 10^6 }[/math]	ci = Anzahl an ausrichtbaren reads für ein Transkript 'i' Li = Länge des Transkripts/Gens 'i' in bp N = Gesamtanzahl an ausrichtbaren reads in Millionen

Wenn 1 Millionen Transkripte sequenziert würden, wäre TPM_i die Anzahl an Transkripten des Types 'i'.

Beispiel:

• [math]\displaystyle{ TPM (A) = \frac{ 12}{600} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {12}{600} + \dfrac {24}{1100} + \dfrac {11}{1400}} \cdot 10^6 = 402614 }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ TPM (B) = \frac{ 24}{1100} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {12}{600} + \dfrac {24}{1100} + \dfrac {11}{1400}} \cdot 10^6 = 439216 }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ TPM (C) = \frac{ 11}{1400} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {12}{600} + \dfrac {24}{1100} + \dfrac {11}{1400}} \cdot 10^6 = 158170 }[/math]
  

Nach der Normalisierung ist ein Vergleich der Genexpressionen möglich. Das Ergebnis gibt an, wie viele Transkripte der Gene entstehen würden, wenn 1 Millionen Transkripte sequenziert werden würden. So würde man z.B. für Gen B 429216 Transkripte erhalten und für Gen C 158170 Transkripte, somit wird Gen B stärker exprimiert, als Gen C. Die Summe der reads ergibt 1 Million.

Probleme von RPKM und TPM:

Die beiden Methoden sind nur gut geeignet, um Expressionswerte bzw. Expressionslevel innerhalb einer Probe zu vergleichen.Von sehr heterologen Expressionsprofilen zwischen zwei Proben können identische Genexpressionen fälschlicherweise als unterschiedlich erkannt werden.

Lösung: TMM als Normalisierungsmethode zwischen Proben

TMM

TMM steht für 'Trimmed mean of M-values normalization method'.

• Gesamtexpressionsstärke pro Probe wird bestimmt, um einzelne Genexpressionen zu bestimmen.
• Das Expressionsverhältnis zwischen zwei Bedingungen für ein Gen 'g' wird bestimmt.
• Genexpressionen von zwei Proben mit unterschiedlichen Bedingungen (z.B. krank und gesund) können miteinander verglichen werden.
  

1. Bestimmung des Gewichtungsfaktors für das Expressionsverhältnis für Gen 'g' zwischen Probe 'k' ' und 'k'. Dabei werden kleinere Werte verstärkt und große abgeschwächt.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ W_\text{gk}^\text{k`} = \frac{ N_\text{k} - Y_\text{gk}}{N_\text{k} \cdot Y_\text{gk}} + \frac{ N_\text{k`} - Y_\text{gk`}}{N_\text{k`} \cdot Y_\text{gk`}} }[/math]	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

2. Mittelwert aller Expressionsverhältnisse wird berechnet.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} = log_2 \dfrac { \dfrac {Y_\text{gk}}{N_\text{k}}}{ \dfrac {Y_\text{gk`}}{N_\text{k`}}} }[/math]	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

3. Gewichtete Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse können berechnet werden. Einsetzen der in 1. und 2. ermittelten Werte.

[math]\displaystyle{ TMM = 2^{log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`})} }[/math]

Gesamt:

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`}) = \frac{ \underset {g \in G}{\sum} W_\text{gk}^\text{k´} \cdot M_\text{gk}^\text{k´}} { \sum_{g \in G} W_\text{gk}^\text{k´}} }[/math]	[math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} = }[/math] Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse [math]\displaystyle{ W_\text{gk}^\text{k`} = }[/math] Gewichtungsfaktor der Expressionsverhältnisse G = Set aller Gene

Bedingungen für dieses Verfahren:

• Y_gk , Y_gk' > 0
• Die oberen und unteren 30 % der [math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} }[/math] Werte werden nicht berücksichtigt
• Die 5 % am höchsten und niedrigsten exprimierten Gene werden nicht berücksichtigt

Beispielrechnung

Gen       Zustand 1[bp]         Zustand 2[bp]
A         200                   600
B         600                   0 
C         800                   960
D         400                   480

Summe     2000                  1680

Folgende Dinge gelten nun:
* TMM braucht immer einen Referenzwert (hier: Zustand 1); Wenn man mehrere Proben hätte, könnte man diese alle an Zustand 1 messen.

• Zuerst normalisiert man die Counts innerhalb der Probe

Ya/N Yb/N
A [math]\displaystyle{ \frac{200}{2000}=0,1 }[/math] [math]\displaystyle{ \frac{240}{1680}=0,143 }[/math]
B [math]\displaystyle{ \frac{600}{2000}=0,3 }[/math] [math]\displaystyle{ \frac{0}{1680}=0 }[/math]
C [math]\displaystyle{ \frac{800}{2000}=0,4 }[/math] [math]\displaystyle{ \frac{960}{1680}=0,571 }[/math]
D [math]\displaystyle{ \frac{400}{2000}=0,2 }[/math] [math]\displaystyle{ \frac{2480}{1680}=0,286 }[/math]

• Mittelwert der Expressionsverhältnisse

Ma/b A [math]\displaystyle{ log_{2} \frac{0,143}{0,1}=0,516 }[/math]
B [math]\displaystyle{ log_{2} \frac{0}{0,3}= -Inf }[/math]
C [math]\displaystyle{ log_{2} \frac{0,571}{0,4}=0,513 }[/math]
D [math]\displaystyle{ log_{2} \frac{0,286}{0,2}=0,516 }[/math]

• kleiner Praxistipp von eurem Admin: [math]\displaystyle{ log_{2} }[/math] ist der Logarithmus von 2, Es ist nicht der natürliche log, es ist nicht ln, es ist nichts mit eulerscher Zahl oder was eure Taschenrechner sonst noch so hergeben. Also sucht eine Funktion, in der ihr die Basis des log eintragen könnt und gebt dort eine 2 ein.

• Nun kommt der Gewichtungsfaktor ins Spiel

Wa/b A [math]\displaystyle{ \frac{1680-240}{1680*240} + \frac{2000-200}{2000*200}=0,081 }[/math]
B [math]\displaystyle{ \frac{1680-0}{1680*0} + \frac{2000-600}{2000*600}= -Inf }[/math]
C [math]\displaystyle{ \frac{1680-960}{1680*960} + \frac{2000-800}{2000*800}=0,0012 }[/math]
D [math]\displaystyle{ \frac{1680-480}{1680*480} + \frac{2000-400}{2000*400}=0,0035 }[/math]
Summe der Gewichtung 0,0128

• Nun werden die Mittelwerte der Expressionsverhältnisse gewichtet (durch den Gewichtungsfaktor)

A 0,516 * 0,081 = 0,0042 B - C 0,513 * 0,0012 = 0,0006 D 0,516 * 0,0018 = 0,0018 Summe 0,0066

Nun wird TMM berechnet:
[math]\displaystyle{ \frac{\text{Summe der gewichteten Mittelwerte der Expressionsverhältnisse}}{\text{Summe Gewichtungsfaktoren}}=log_{2}(TMM) }[/math]

[math]\displaystyle{ \frac{0,0066}{0,0128}=0,51=log_{2}(TMM) }[/math]

• Jetzt noch die Formel umsetzen:

[math]\displaystyle{ log_{2}(TMM)= x }[/math] [math]\displaystyle{ 2^{x} = TMM }[/math] [math]\displaystyle{ 2^{0,51} = 1,4296 }[/math]