2 Transkriptom RNA Seq 1

Biologische Fragestellung

Das NAT8L Gen scheint im Metabolismus von Krebszellen eine Rolle zu spielen. Unser Projekt befasst sich mit Lungenkrebs. Daraus folg folgende Frage: Ist NAT8L in Lungenkrebszellen erhöht exprimiert ?
Die Frage impliziert weitere Überlegungen z.B. ob NAT8L essentiell für das Wachstum von Krebszellen ist und ob eine Inhibierung der NAT8L Expression die Tumorbildung hemmen würde.

Um die Frage zu beantworten sind folgende drei Schritte notwendig:
Schritt 1:

• Abfragen von Datenbanken (vielleicht wurden bereits ähnliche Experimente durchgeführt)
  

Schritt 2:

• aus Datenbanken haben wir herausgefunden, dass NAT8L in Lungenkrebszellen erhöht expliziert wird
  

Schritt 3:

• in einem Experiment soll versucht werden die Genexpression durch RNAi (RNA interference) zu silencen

• aus zwei Tumorzellkulturen wird die mRNA extrahiert
• mit Hilfe der reversen Transkriptase wird cDNA transkribiert
• cDNA wird sequenziert
• Sequenzunterschiede können analysiert werden
  

Dem Experiment liegt die Transkriptomanalyse zugrunde, welche eine quantitative und qualitative Bestimmung aller Transkriptionsaktivitäten ermöglicht. D.h. die Erfassung aller mRNA-Moleküle, wodurch auf die Aktivität bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zurückschließen lässt. Zum Ablauf der Transkriptomanalyse durch RNA-Sequenzierung vergleiche 5.Transkriptom RNA Seq 2

Sequenzierung

Für die quantitativen und qualitativen Bestimmungen von Sequenzen bei der Transkriptomanalyse durch die RNA-Sequenzierung müssen, wie der Name schon verrät, die cDNA-Sequenzen sequenziert werden.

Next Generation Sequencing (NGS)

Illumina Sequencing (2nd Generation Sequencing)

File:Cluster Generation.png

1. Nach der Fragmentierung und Legierung der Adapter-Molekülen, heften sich die Fragmente an komplementäre Adaptersequenzen in der "flow cell". 2. Die DNA biegt sich um den zweiten Adapter zu hybridisieren. 3-4. Die Polymerase synthetisiert den komplementären Strang. 5. Die Stränge denaturieren und bilden neue Brücken. Das Resultat sind Cluster der DNA-Stränge.

Ergebnis der Illumina Sequenzierung:

• Länge der reads 50-600bp
• Fehlerrate ca. 0,1%
• humanes Genom kann 30x am Tag sequenziert werden
• Daten werden in FASTQ Format geliefert

FASTQ

Die NGS-Sequenzierergebnisse werden in diesem textbasierten-Format geliefert, dass zur Speicherung von DNA/RNA-Sequenzen dient. Eine FASTQ-Datei ist folgendermaßen aufgebaut:

@ Identifier  # Sequenz identifier
GATCTT        # Sequenz
+             # optionale Beschreibung
!'CC'*+*!?    # Qualität jedes Nukleotids (Zahlenwert repräsentiert durch ASCII Tabelle)

Problem

Viele kurze reads, die in einen Zusammenhang gebracht werden müssen! Um Lücken in der Sequenz zu vermeiden, muss die Sequenziertiefe angepasst werden.

Sequenzabdeckung

G: Länge der Genomsequenz
N: Anzahl der reads
L: durchschnittliche Länge der reads
C: Coverage (Abdeckung)

[math]\displaystyle{ C= \frac{N*L}{G} }[/math]

Lander-Waterman-Modell

Mathematisches Modell zur Errechnung, durch Sequenzierung, nicht abgedeckter Basenpaare.

P_{[nicht abgedecktes Bp]} = e^-c

Beispiele:
C=10 → 1 Gap in 22000 Bp

C=22 → 1 Gap in 3,6*10⁹ Bp

C=30 → So tief, dass quasi alles überdeckt wird

Assemblierung der reads

Aus der RNA-Seq erhaltene Fragmente sequenzierter RNA. Diese werden anschließend dem Referenzgenom (Template) zugeordnet werden.

-A

-C

-C

-T

-G

-A

-C

T

-A

-G

-C

-T

-G

-A

-T

-C

-A

-A

-G

-G

-

-

Template

-G

-A

-T

-C

-A

-A

-A

-G

-C

-T

-G

-A

-A

-C

G

-A

-G

-C

-T

-

-

Punktmutation

-G

-A

-_

-C

-A

-A

-G

-G

-

-

Deletion

Damit die reads in Zusammenhang gebracht werden können müssen diese assembliert werden. Assembly ist ein Bioinformatisches Verfahren, bei dem überlappende reads zu Contiqs und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt werden. Wenn das Genom bereits bekannt ist können die Scaffolds an ein Referenzgenom aligned werden:

Contiq: Zusammenhängender Abschnitt einer genomischen Sequenz, die aus überlappenden reads gebildet wird. Zwischen ihnen befinden sich noch Lücken.

Scaffold: Bestehend aus Contiqs und Lücken (auch Supercontiqs genannt); definieren die Reihenfolge, Orientierung und Größe der Lücken zwischen den Contiqs.