6 Normalisierungen

Normalisierungen

Normalisierungen der RNASeq-Daten sind notwendig, um diese vergleichbar machen zu können und die tatsächliche Genexpression quantifizieren zu können.

RPKM

RPKM steht für 'Reads per kilobase of transcript per Million mapped reads' und ist eine Normalisierungsmethode für Expressionsstärken.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ RPKM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i} \cdot N} }[/math]	ci = Anzahl an ausrichtbaren reads für ein Transkript 'i' Li = Länge des Transkripts/Gens 'i' in kbp N = Gesamtanzahl an ausrichtbaren reads in Millionen

 [math]\displaystyle{    \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}}  }[/math]  → Normalisierung der Genlänge 

 [math]\displaystyle{  L_\text{i} \cdot N  }[/math] → Normalisierung der Sequenziertiefe 

Je höher der RPKM-Wert ist, desto höher ist die Genexpression.
RPKM-Werte können gut zum Vergleich der Genexpressionen innerhalb einer Probe genutzt werden, jedoch sind sie nicht dafür geeignet mehrere Experimente bzw. Proben miteinander zu vergleichen.

Beispiel:

• [math]\displaystyle{ RPKM (A) = \frac{12}{0,6 kbp \cdot 6 \cdot 10^6} = 3,33 \cdot 10^{-6} }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ RPKM (B) = \frac{24}{1,1 kbp \cdot 6 \cdot 10^6} = 3,64 \cdot 10^{-6} }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ RPKM (C) = \frac{12}{1,4 kbp \cdot 6 \cdot 10^6} = 1,43 \cdot 10^{-6} }[/math]
  
  

Durch die Normalisierung der Expressionsstärken können diese nun miteinander vergleichen werden.In diesem Beispiel wird Gen B am stärksten exprimiert und Gen C am schwächsten.

TPM

TPM steht für 'Transcripts per Million' und ist eine Normalisierungsmethode für Expressionsstärken.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ TPM = \frac{ c_\text{i}}{L_\text{i}} \cdot \dfrac {1}{\sum_\text{n} \dfrac {c_\text{n}}{L_\text{n}}} \cdot 10^6 }[/math]	ci = Anzahl an ausrichtbaren reads für ein Transkript 'i' Li = Länge des Transkripts/Gens 'i' in bp N = Gesamtanzahl an ausrichtbaren reads in Millionen

Wenn 1 Millionen Transkripte sequenziert würden, wäre TPM_i die Anzahl an Transkripten des Types 'i'.
Beispiel:

• [math]\displaystyle{ TPM (A) = \frac{ 12}{600} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {12}{600} + \dfrac {24}{1100} + \dfrac {11}{1400}} \cdot 10^6 = 402614 }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ TPM (B) = \frac{ 24}{1100} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {12}{600} + \dfrac {24}{1100} + \dfrac {11}{1400}} \cdot 10^6 = 439216 }[/math]
  

• [math]\displaystyle{ TPM (C) = \frac{ 11}{11400} \cdot \dfrac {1}{ \dfrac {12}{600} + \dfrac {24}{1100} + \dfrac {11}{1400}} \cdot 10^6 = 158170 }[/math]
  

Nach der Normalisierung ist ein Vergleich der Genexpressionen möglich. Das Ergebnis gibt an, wie viele Transkripte der Gene entstehen würden, wenn 1 Millionen Transkripte sequenziert werden würden. So würde man z.B. für Gen B 429216 Transkripte erhalten und für Gen C 158170 Transkripte, somit wird Gen B stärker exprimiert, als Gen C.

TMM

TMM steht für 'Trimmed mean of M-values normalization method'.

Probleme von RPKM und TPM:

1. Sie sind nur gut geeignet, um Expressionswerte bzw. Expressionslevel innerhalb einer Probe zu vergleichen.
   
2. Von sehr heterologen Expressionsprofilen zwischen zwei Proben können identische Genexpressionen fälschlicherweise als unterschiedlich erkannt werden.
   

Lösung:
→ TMM als Normalisierungsmethode zwischen Proben

• Gesamtexpressionsstärke pro Probe wird bestimmt, um einzelne Genexpressionen zu bestimmen.
  
• Das Expressionsverhältnis zwischen zwei Bedingungen für ein Gen 'g' wird bestimmt.
• Genexpressionen von zwei Proben mit unterschiedlichen Bedingungen (z.B. krank und gesund) können miteinander verglichen werden.
  

1. Bestimmung des Gewichtungsfaktors für das Expressionsverhältnis für Gen 'g' zwischen Probe 'k' ' und 'k'. Dabei werden kleinere Werte verstärkt und große abgeschwächt.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ W_\text{gk}^\text{k`} = \frac{ N_\text{k} - Y_\text{gk}}{N_\text{k} \cdot Y_\text{gk}} + \frac{ N_\text{k`} - Y_\text{gk`}}{N_\text{k`} \cdot Y_\text{gk`}} }[/math]	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

2. Mittelwert aller Expressionsverhältnisse wird berechnet.

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} = log_2 \dfrac { \dfrac {Y_\text{gk}}{N_\text{k}}}{ \dfrac {Y_\text{gk`}}{N_\text{k`}}} }[/math]	Ygk = Beobachtete Anzahl an reads für Gen 'g' und Probe 'k' Nk = Gesamtanzahl an reads für Probe 'k' k' = 2. Probe (Referenz-Bedingung)

3. Gewichtete Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse können berechnet werden. Einsetzen der in 1. und 2. ermittelten Werte.

[math]\displaystyle{ TMM = 2^{log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`})} }[/math]

Formel	Parameter
[math]\displaystyle{ log_2 (TMM_\text{k}^\text{k`}) = \frac{ \underset {g \in G}{\sum} W_\text{gk}^\text{k´} \cdot M_\text{gk}^\text{k´}} { \sum_{g \in G} W_\text{gk}^\text{k´}} }[/math]	[math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} = }[/math] Mittelwerte aller Expressionsverhältnisse [math]\displaystyle{ W_\text{gk}^\text{k`} = }[/math] Gewichtungsfaktor der Expressionsverhältnisse G = Set aller Gene

Bedingungen für dieses Verfahren:

• Y_gk , Y_gk' > 0
• Die oberen und unteren 30 % der [math]\displaystyle{ M_\text{gk}^\text{k`} }[/math] Werte werden nicht berücksichtigt
• Die 5 % am höchsten und niedrigsten exprimierten Gene werden nicht berücksichtigt

Beispielrechnung:
Gen       Zustand 1[bp]         Zustand 2[bp]
A         200                   600
B         600                   0 
C         800                   960
D         400                   480

*Berechnet gleich die Summe der Counts N, ihr werdet sie brauchen
Summe     2000                  1680

Folgende Dinge gelten nun:
*TMM braucht immer ein Referenzwert (hier: Zustand 1); Wenn man mehrere Proben hätte, könnte man diese alle an Zustand 1 messen. Einer Vergleichbarkeit anhand eines Referenzwertes zu schaffen ist sozusagen der Zweck von TMM.

* Zuerst normalisiert man die Counts innerhalb der Probe
Y a/N
[math]\displaystyle{ 
 \frac{200}/{2000}=0,1
  }[/math]