2 Transkriptom RNA Seq 1

Auf dieser Seite sind die Themen zusammengeführt, die in Vorlesung 2 am 18.04.2019 behandelt wurden.

Biologische Fragestellung

Da NAT8L in euren Prostatakarzinomzellen erhöht exprimiert ist, habt ihr euch entschlossen die Genexpression durch RNAi (RNA Interferenz) zu silencen.

Experiment

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Sanger Methode

Als Wiederholung:

Next Generation Sequencing (NGS)

Illumina Sequencing (2nd Generation Sequencing)

Ergebnis der Illumina Sequenzierung:

• Länge der reads 50-600bp
• Fehlerrate ca. 0,1%
• humanes Genom kann 30x am Tag sequenziert werden
• Daten werden in FASTQ Format geliefert

FASTQ

Eine FASTQ-Datei ist folgendermaßen aufgebaut:

@identifier ← Sequenz ID
GATCTT ← Sequenz
+ irgendeine Beschreibung ← optionale Beschreibung
!'CC'*+*!? ← Qualität für jedes Level (Zahlenwert repräsentiert durch ASCII Tabelle

Problem

Viele kurze reads, die in einen Zusammenhang gebracht werden müssen!

Sequenzabdeckung

G: Länge der Genomsequenz
N: Anzahl der reads
L: durchschnittliche Länge der reads
c: Coverage (Abdeckung)

«insert Formel hier»

Lander-Waterman-Modell

Mathematisches Modell zur Errechnung, durch Sequenzierung, nicht abgedeckter Basenpaare.

P_{[nicht abgedecktes Bp]} = e^-c

Beispiele:
c=10 → 1 Gap in 22000 Bp
c=22 → 1 Gap in 3,6*10⁹ Bp

(c meist bei 30)

Assemblierung der reads

A

C

C

T

G

A

C

T

A

G

C

T

G

A

T

C

A

A

G

G

-

-

Template

G

A

T

C

A

A

A

G

C

T

G

A

A

C

G

A

G

C

T

-

-

Punktmutation

G

A

_

C

A

A

G

G

-

-

Deletion