5 Transkriptom RNA Seq 2

RNAseq

1. Isolierung von mRNA

• nur 1-2% der totalen RNA ist mRNA
• 90% rRNA
  • poly(A) Anreicherung
  • Abbau von rRNA

2. cDNA Synthese und Library Präparation

• Information über kodierenden Strang kann durch 2-stufige cDNA Synthese und dUTP Nukleotiden konserviert werden.

A	U	G	U	C	G	A			mRNA
T	A	C	A	G	C	U			1. cDNA Strang
T	A	C	A	G	C	U
A	U	G	U	C	G	A			2. cDNA Strang mit dUTPs statt dTTPs

⇒ Library Präparation, Adapter Legierung
⇒ Abbau des 2. Strangs durch Uracil-DNA Glykosylase
→ PCR/ Amplifizierung / Sequenzierung

3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing

⇒ Sequenziertiefe bestimmt die Empfindlichkeit und die Genauigkeit
⇒ 5 Millionen reads ausreichend für mittel-hoch exprimierte Gene
⇒ 100 Millionen reads für schwach exprimierte Gene
⇒ Wichtig: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede

	Replikate pro Gruppe
fold change	3	5	10
1,25	17%	25%	44%
1,5	43%	64%	91%
2	87%	98%	100%

4. Präprozessierung der Rohdaten

⇒ Filtern von Basen mit geringer Qualität
⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen

Programme: FASTQC, NGSQC, Trimmomatic

5. Read Alignment