RNAseq - Revision history

Mka at 15:32, 28 January 2021

2021-01-28T15:32:32Z

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	~~RNAseq~~ ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle ermittelt.		RNA sequencing ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle durch Next-Generation Sequencing (NGS) ermittelt.

	== Durchführung ==		== Durchführung ==

	Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen ~~Umgegungen~~ natürlich vorkommen und die RNA abbauen können.		Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen Umgebungen natürlich vorkommen und die RNA abbauen können.

	Im zweiten Schritt wird die cDNA mit Realtime PCR amplifiziert, damit ~~man~~ eine bekannt Menge an cDNA in den Sequencer ~~geben~~ kann.		Im zweiten Schritt wird die cDNA mit Realtime PCR amplifiziert, damit eine bekannt Menge an cDNA in den Sequencer gegeben werden kann.

	Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit ~~Next~~-~~Generation-Sequencing~~ Methoden (z.B. [[Illumina]]) sequenziert. Die ~~Fragmentsequenzen~~ (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten.		Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit NGS-Methoden (z.B. [[2_Transkriptom_RNA_Seq_1#Next_Generation_Sequencing_.28NGS.29\|Illumina]]) sequenziert. Die fragmentierten Sequenzen (''reads'') müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[2_Transkriptom_RNA_Seq_1#Assemblierung_der_reads\|Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten. Unter anderem, können die ''reads'' durch das Zuordnen an ein Referenzgenom zusammengefügt werden ([[3_Alignments\|Alignment]]).

	== Vorteile ~~der RNAseq~~ ==		== Vorteile ==

	Vorteilhaft an der RNA-seq gegenüber [[Microarrays\|Microarray]] ist, dass die Auflösung auf die Base genau ist. Da man die genaue Sequenz besitzt kann man deshalb einfach zwischen verschieden Mutanten und Splicevarianten unterscheiden. Außerdem besitzt diese Methode viel weniger Hintergrundrauschen und hat keine Messobergrenze, das heisst auch besonders hohe Expressionslevel können noch akkurat erfasst werden. Außerdem ist die benötigte RNA-Menge weitaus weniger im Vergleich zu Microarrays.		Vorteilhaft an der RNA-seq gegenüber [[Microarrays\|Microarray]] ist, dass die Auflösung auf die Base genau ist. Da man die genaue Sequenz besitzt kann man deshalb einfach zwischen verschieden Mutanten und Splicevarianten unterscheiden. Außerdem besitzt diese Methode viel weniger Hintergrundrauschen und hat keine Messobergrenze, das heisst auch besonders hohe Expressionslevel können noch akkurat erfasst werden. Außerdem ist die benötigte RNA-Menge weitaus weniger im Vergleich zu Microarrays. Auch Proben von unbekannten Organismen können sequenziert werden.

Patrick Melichar: /* Durchführung */

2019-05-08T17:10:09Z

Durchführung

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	Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen Umgegungen natürlich vorkommen und die RNA abbauen können.		Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen Umgegungen natürlich vorkommen und die RNA abbauen können.

			Im zweiten Schritt wird die cDNA mit Realtime PCR amplifiziert, damit man eine bekannt Menge an cDNA in den Sequencer geben kann.

	Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit Next-Generation-Sequencing Methoden (z.B. [[Illumina]]) sequenziert. Die Fragmentsequenzen (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten.		Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit Next-Generation-Sequencing Methoden (z.B. [[Illumina]]) sequenziert. Die Fragmentsequenzen (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten.

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2019-05-08T16:08:12Z

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RNAseq ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle ermittelt.

== Durchführung ==

Nach der Isolierung der RNA aus der Probe muss die RNA fragmentiert werden und mit dem Enzym reverser Transkriptase in cDNA übersetzt werden. Dies liegt daran, dass RNA von sich aus weitaus instabiler ist und RNasen in vielen Umgegungen natürlich vorkommen und die RNA abbauen können.

Die fragmentierte cDNA wird anschließend mit Next-Generation-Sequencing Methoden (z.B. [[Illumina]]) sequenziert. Die Fragmentsequenzen (reads) müssen anschließend mit bioinformatische Methoden wieder zusammengefügt werden ([[Assembly]]) um Aufschluss auf das Transkriptom zu erhalten.

== Vorteile der RNAseq ==

Vorteilhaft an der RNA-seq gegenüber [[Microarrays|Microarray]] ist, dass die Auflösung auf die Base genau ist. Da man die genaue Sequenz besitzt kann man deshalb einfach zwischen verschieden Mutanten und Splicevarianten unterscheiden. Außerdem besitzt diese Methode viel weniger Hintergrundrauschen und hat keine Messobergrenze, das heisst auch besonders hohe Expressionslevel können noch akkurat erfasst werden. Außerdem ist die benötigte RNA-Menge weitaus weniger im Vergleich zu Microarrays.