5 Transkriptom RNA Seq 2 - Revision history

Skl at 13:20, 30 September 2021

2021-09-30T13:20:00Z

← Older revision		Revision as of 15:20, 30 September 2021
Line 66:		Line 66:
	* BAM= Binary Alignment/Map		* BAM= Binary Alignment/Map
	* SAM ist ein textbasiertes Dateiformat und BAM ein binäres Dateiformat.		* SAM ist ein textbasiertes Dateiformat und BAM ein binäres Dateiformat.

			== Sequenziertiefe ==
			Die Sequenziertiefe gibt an, wie oft ein bestimmter Abschnitt eines Genoms sequenziert wurde und bestimmt damit die Empfindlichkeit und Genauigkeit einer Sequenzierung.
			<center><math> Sequenziertiefe= \frac{\text{mapped reads * Fragmentlänge}}{\text{effective Genomgröße}}</math></center>

Skl: /* 3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing */

2021-09-28T18:37:15Z

3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing

← Older revision		Revision as of 20:37, 28 September 2021
Line 47:		Line 47:
	\|}		\|}
	</big>		</big>
			* die Tabelle stellt die Wahrscheinlichkeit dar, einen bestimmten fold change bei einer bestimmten Anzahl an Repliken zu delektieren bzw. statistisch signifikant zu finden

	== 4. Datenanalyse ==		== 4. Datenanalyse ==
	Präsprozessierung der Rohdaten:		Präsprozessierung der Rohdaten:

Skl: /* 5. Read Alignment */

2021-09-27T14:30:22Z

5. Read Alignment

← Older revision		Revision as of 16:30, 27 September 2021
Line 58:		Line 58:
	== 5. Read Alignment ==		== 5. Read Alignment ==
	[[File:Read-alignment.png\|center\|1000px]]		[[File:Read-alignment.png\|center\|1000px]]

			=== SAM und BAM Format ===
			* Enthält Informationen über die Sequenz-reads nach dem Alignment an ein Referenzgenom.
			* SAM= Sequence Alignment/Map
			* BAM= Binary Alignment/Map
			* SAM ist ein textbasiertes Dateiformat und BAM ein binäres Dateiformat.

Skl: /* 4. Datenanalyse */

2021-09-27T13:57:58Z

4. Datenanalyse

← Older revision		Revision as of 15:57, 27 September 2021
Line 50:		Line 50:
	Präsprozessierung der Rohdaten:		Präsprozessierung der Rohdaten:
	<br>		<br>
	⇒Filtern von Basen mit geringer ~~Qualität~~		⇒Filtern von Basen mit geringer Sequenzierqualität
	<br>		<br>
	⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen		⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen

Skl: /* 2. cDNA Synthese und Library Präparation */

2021-09-27T13:44:06Z

2. cDNA Synthese und Library Präparation

← Older revision		Revision as of 15:44, 27 September 2021
Line 20:		Line 20:
	[[File:RNA-Seq.png\|400px\|center\|thumb]]		[[File:RNA-Seq.png\|400px\|center\|thumb]]

	* Abbau des non ~~Coding~~ Stranges durch durch ~~URacil~~-DNA-Glykosylase		* Abbau des non-coding Stranges durch durch Uracil-DNA-Glykosylase
	* baut spezifisch den non coding Strang ab, weil dieser als einziger Uracil besitzt		* baut spezifisch den non-coding Strang ab, weil dieser als einziger Uracil besitzt
	* d.h. alle zum cDNA-Originalstrang komplementären Stränge werden abgebaut		* d.h. alle zum cDNA-Originalstrang komplementären Stränge werden abgebaut
	* durch die Adapter bleibt die Topologie erhalten		* durch die Adapter bleibt die Topologie erhalten

Skl: /* 2. cDNA Synthese und Library Präparation */

2021-09-27T13:40:40Z

2. cDNA Synthese und Library Präparation

← Older revision		Revision as of 15:40, 27 September 2021
Line 18:		Line 18:


	~~3' UUUUU~~-~~AAAA 5' mRNA mit polyA tail <br>~~		[[File:RNA-Seq.png\|400px\|center\|thumb]]
	~~↓Reverse Transcriptase <br>~~
	~~3' AAAAA-TTTT 5' cDNA Strang wird mit Reverse Transkriptase synthetisiert <br>~~
	~~↓Synthese des komplementären cDNA Strangs durch Polymerase <br>~~
	~~3' AAAAA-TTTT 5' <br>~~
	~~5' UUUUU-AAAA 3' cDNA Doppelstrang, dUTPs werden hinzugegeben keine dTTPs, dadurch Markierung des non-coding Strangs <br>~~
	~~A-A A-A A-TTT <br>~~
	~~U-U U-U U-AAA library preparation und Adapter Ligierung <br>~~

	* Abbau des non Coding Stranges durch durch URacil-DNA-Glykosylase		* Abbau des non Coding Stranges durch durch URacil-DNA-Glykosylase

Skl at 11:29, 23 September 2021

2021-09-23T11:29:50Z

← Older revision		Revision as of 13:29, 23 September 2021
Line 6:		Line 6:
	* nur 1-2% der totalen RNA ist mRNA		* nur 1-2% der totalen RNA ist mRNA
	* 90% rRNA		* 90% rRNA
	** poly(A) Anreicherung		* weil wir nur die mRNA isolieren wollen, müssen wir diese von der restlichen RNA trennen
	** Abbau von rRNA		* das ist entweder durch die sogennante poly(A) Anreicherung möglich, dabeimacht man sich die besondere Eigenschaft der mRNA zu nutze
			* diese besitzt im Gegensatz zu anderen RNA Spezies einen polyA-Schwanz, immobilisiert man auf der Matrix einer Chromatofraphiesäule polyT-Seqeunezen, kann die mRNA komplementär an diese binden und kann so hufgereinigt werden
			* die zweite Möglichkeit ist der spezifische Abbau von rRNA
			* diese Vorgehensweise gewinnt vor allem bei Prokaryotischer mRNA an Bedeutung, bei der es keinen polyA-Schwanz gibt
	<br>		<br>
	<br>		<br>
Line 13:		Line 16:
	*Information über kodierenden Strang kann durch 2-stufige cDNA Synthese und dUTP Nukleotiden konserviert werden.		*Information über kodierenden Strang kann durch 2-stufige cDNA Synthese und dUTP Nukleotiden konserviert werden.
	<br>		<br>
	~~<big>~~
	{\|
	\|-		3' UUUUU-AAAA 5' mRNA mit polyA tail <br>
	~~\| A\|\| U\|\| G\|\| U\|\| C\|\| G\|\| A\|\|  \|\| \|\|mRNA~~		↓Reverse Transcriptase <br>
	\|-		3' AAAAA-TTTT 5' cDNA Strang wird mit Reverse Transkriptase synthetisiert <br>
	~~\| T\|\| A\|\| C\|\| A\|\| G\|\| C\|\| U\|\|  \|\| \|\|1.~~ cDNA ~~Strang~~		↓Synthese des komplementären cDNA Strangs durch Polymerase <br>
	\|-		3' AAAAA-TTTT 5' <br>
	~~\| T\|\| A\|\| C\|\| A\|\| G\|\| C\|\| U\|\|  \|\| \|\|~~		5' UUUUU-AAAA 3' cDNA Doppelstrang, dUTPs werden hinzugegeben keine dTTPs, dadurch Markierung des non-coding Strangs <br>
	\|-		A-A A-A A-TTT <br>
	~~\| A\|\| U\|\| G\|\| U\|\| C\|\| G\|\| A\|\|  \|\| \|\|2. cDNA Strang mit~~ dUTPs ~~statt~~ dTTPs		U-U U-U U-AAA library preparation und Adapter Ligierung <br>
	\|-
	\|}		* Abbau des non Coding Stranges durch durch URacil-DNA-Glykosylase
	<~~/big~~>		* baut spezifisch den non coding Strang ab, weil dieser als einziger Uracil besitzt
	<br>		* d.h. alle zum cDNA-Originalstrang komplementären Stränge werden abgebaut
	~~⇒ Library Präparation,~~ Adapter ~~Legierung~~		* durch die Adapter bleibt die Topologie erhalten
	<br>		* es folgt die Amplifikation mittels PCR
	~~⇒~~ Abbau des ~~2. Strangs~~ durch ~~Uracil~~-DNA Glykosylase
	~~<br>~~
	→ PCR~~/ Amplifizierung / Sequenzierung~~
	~~<br>~~
	~~<br>~~
	== 3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing ==		== 3. Sequenzierung/ Next generation Sequencing ==
	~~<br>~~		* Sequenziertiefe bestimmt die Empfindlichkeit und die Genauigkeit
	~~<br>~~		* 5 Millionen reads ausreichend für mittel-hoch exprimierte Gene
	~~⇒~~ Sequenziertiefe bestimmt die Empfindlichkeit und die Genauigkeit		* 100 Millionen reads für schwach exprimierte Gene
	~~<br>~~		* wichtig: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede
	~~⇒~~ 5 Millionen reads ausreichend für mittel-hoch exprimierte Gene
	~~<br>~~
	~~⇒~~ 100 Millionen reads für schwach exprimierte Gene
	~~<br>~~
	~~⇒ Wichtig~~: Anzahl an Replikaten bestimmt statistische Sensitivität für Unterschiede

	<big>		<big>
Line 60:		Line 54:
	\|}		\|}
	</big>		</big>
	== 4. ~~Präprozessierung~~ der Rohdaten ==		== 4. Datenanalyse ==
			Präsprozessierung der Rohdaten:
	<br>		<br>
	⇒ Filtern von Basen mit geringer Qualität		⇒Filtern von Basen mit geringer Qualität
	<br>		<br>
	⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen		⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen
Line 69:		Line 64:

	== 5. Read Alignment ==		== 5. Read Alignment ==
	[[File:Read-alignment.png\|~~frameless~~\|1000px]]		[[File:Read-alignment.png\|center\|1000px]]

Skl at 10:40, 21 September 2021

2021-09-21T10:40:13Z

← Older revision		Revision as of 12:40, 21 September 2021
Line 1:		Line 1:

	= RNAseq =		= RNAseq =
			RNA sequencing ist eine Methode zur Analyse von Transkriptomen. Hierbei wird die Sequenz aller in der Probe vorhandenen mRNA Moleküle durch Next-Generation Sequencing (NGS) ermittelt.
	<br>		<br>
	== 1. Isolierung von mRNA ==		== 1. Isolierung von mRNA ==

Mka: /* 4. Präprozessierung der Rohdaten */

2021-01-31T11:59:44Z

4. Präprozessierung der Rohdaten

← Older revision		Revision as of 13:59, 31 January 2021
Line 65:		Line 65:
	⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen		⇒ Trimmen von Adaptersequenzen und PCR-Primersequenzen
	<br>		<br>
	~~<br>~~		⇒ Programme: FASTQC, NGSQC, Trimmomatic
	~~<big>~~
	Programme: FASTQC, NGSQC, Trimmomatic
	~~</big>~~
	== 5. Read Alignment ==		== 5. Read Alignment ==
	[[File:Read-alignment.png\|frameless\|1000px]]		[[File:Read-alignment.png\|frameless\|1000px]]

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2020-05-19T12:00:43Z

Pge moved page Vorlesung 5 to 5 Transkriptom RNA Seq 2

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Revision as of 14:00, 19 May 2020