5.Transkriptom RNA Seq 2 - Revision history

Mka: /* Aufgabe 3: Sequenzierung mit FASTQ-Format */

2021-01-31T18:17:19Z

Aufgabe 3: Sequenzierung mit FASTQ-Format

← Older revision		Revision as of 20:17, 31 January 2021
Line 97:		Line 97:
	'''a''': Ihr erhaltet Sequenzierdaten im FASTQ-Format. Die Datei hat 20 Millionen Zeilen.		'''a''': Ihr erhaltet Sequenzierdaten im FASTQ-Format. Die Datei hat 20 Millionen Zeilen.

	i) Wie viele „reads“ habt ihr erhalten? Erkläre, wieso.		i) Wie viele „reads“ habt ihr erhalten? Erkläre, wieso.

	Wir haben 5 Mio. read erhalten, denn jeder ~~Read~~ nimmt insgesamt 4 Zeilen ein.		Wir haben 5 Mio. read erhalten, denn jeder read nimmt insgesamt 4 Zeilen ein.
	Header, Sequence, Descriptor, Quality und 20/4=5		Header, Sequence, Descriptor, Quality und 20/4=5


	ii) Würde die Anzahl an „reads“ ausreichen, um die Expression eines schwach		ii) Würde die Anzahl an „reads“ ausreichen, um die Expression eines schwach
	exprimierten Gens zu quantifizieren?		exprimierten Gens zu quantifizieren?

	Nein, für ein schwach exprimiertes Gen sollte man ca. 100 Mio. Reads anstreben. (da ein möglichst niedriger ~~threshold~~ die größte Chance hat auch schwach exprimierte Gene zu detektieren)		Nein, für ein schwach exprimiertes Gen sollte man ca. 100 Mio. Reads anstreben. (da ein möglichst niedriger Threshold die größte Chance hat auch schwach exprimierte Gene zu detektieren)


Line 133:		Line 133:
	Anzahl an Sequenzierungen, nach denen rein statistisch ein C vorkommt 6010 / 10 = 601		Anzahl an Sequenzierungen, nach denen rein statistisch ein C vorkommt 6010 / 10 = 601

	Bei jedem 601. read würde also rein statistisch ein C rauskommen. Für eine Sequenziertiefe von 10 braucht man also rein statistisch 601 ** 10 = 6010. Nun greift aber natürlich wieder die oben angesprochene Binominalverteilung, da es ja nur ein statistisches Mittel ist und deswegen nicht jedes Mal zufällig so eintritt.		Bei jedem 601. read würde also rein statistisch ein C rauskommen. Für eine Sequenziertiefe von 10 braucht man also rein statistisch 601 * 10 = 6010. Nun greift aber natürlich wieder die oben angesprochene Binominalverteilung, da es ja nur ein statistisches Mittel ist und deswegen nicht jedes Mal zufällig so eintritt.

Mka: /* Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung */

2021-01-31T18:12:40Z

Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung

← Older revision		Revision as of 20:12, 31 January 2021
Line 82:		Line 82:
	'''b''': Was versteht man unter der Sequenziertiefe?		'''b''': Was versteht man unter der Sequenziertiefe?

	~~Unter~~ Sequenziertiefe ~~versteht man die durchschnittliche Anzahl~~ an ~~reads pro Nukleotid der Sequenz. Eine hohe Sequenziertiefe bedeutet somit eine hohe Read-Anzahl im Verhältnis zum (Referenz)-~~Genoms~~. Sie stellt~~ damit ~~einen Wert für~~ Empfindlichkeit und Genauigkeit ~~der~~ Sequenzierung ~~dar~~.		Die Sequenziertiefe gibt an, wie oft ein bestimmter Abschnitt eines Genoms sequenziert wurde und bestimmt damit die Empfindlichkeit und Genauigkeit einer Sequenzierung.


			<center><math> Sequenziertiefe= \frac{\text{mapped reads * Fragmentlänge}}{\text{effective Genomgröße}}</math></center>

	~~'''c''': Wie unterscheiden sich die Ergebnisse einer hohen und einer niedrigen Sequenziertiefe~~
	~~bei der Daten-Interpretation?~~

	~~Eine „flache“ Sequenziertiefe zeigt lediglich stark exprimierte Gene an und ist statistischer~~		'''c''': Wie unterscheiden sich die Ergebnisse einer hohen und einer niedrigen Sequenziertiefe bei der Daten-Interpretation?
	~~weniger aussagekräftig. Eine tiefe Sequenziertiefe zeigt auch schwächer exprimierte Gene an~~
	und ~~ist, da n größer ist, statistischer aussagekräftiger. Eine hohe~~ Sequenziertiefe ~~dauert natürlich länger und ist teurer, sodass sie für eine Suche nach hoch~~-~~exprimierten Gene nicht unbedingt nötig ist. (da hier ein mittlerer threshold ausreichend ist)~~

			Eine niedrige Sequenziertiefe zeigt lediglich stark exprimierte Gene an und ist statistischer weniger aussagekräftig. Eine tiefe Sequenziertiefe zeigt auch schwächer exprimierte Gene an und ist, da n größer ist, statistischer aussagekräftiger. Eine hohe Sequenziertiefe dauert natürlich länger und ist teurer, sodass sie für eine Suche nach hoch-exprimierten Gene nicht unbedingt nötig ist. (da hier ein mittlerer threshold ausreichend ist)


			== Aufgabe 3: Sequenzierung mit FASTQ-Format ==
	Aufgabe 3: Sequenzierung mit FASTQ-Format

	'''a''': Ihr erhaltet Sequenzierdaten im FASTQ-Format. Die Datei hat 20 Millionen Zeilen.		'''a''': Ihr erhaltet Sequenzierdaten im FASTQ-Format. Die Datei hat 20 Millionen Zeilen.

Pge: /* Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung */

2020-10-03T21:27:00Z

Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung

← Older revision		Revision as of 23:27, 3 October 2020
Line 134:		Line 134:
	5000+1000+10 = 6010		5000+1000+10 = 6010

	Anzahl an Sequenzierungen, nach denen ~~reun~~ statistisch ein C vorkommt 6010 // 10 == 601		Anzahl an Sequenzierungen, nach denen rein statistisch ein C vorkommt 6010 / 10 = 601

	Bei jedem 601. read würde also rein statistisch ein C rauskommen. Für eine Sequenziertiefe von 10 braucht man also rein statistisch 601 ** 10 = 6010. Nun greift aber natürlich wieder die oben angesprochene Binominalverteilung, da es ja nur ein statistisches Mittel ist und deswegen nicht jedes Mal zufällig so eintritt.		Bei jedem 601. read würde also rein statistisch ein C rauskommen. Für eine Sequenziertiefe von 10 braucht man also rein statistisch 601 ** 10 = 6010. Nun greift aber natürlich wieder die oben angesprochene Binominalverteilung, da es ja nur ein statistisches Mittel ist und deswegen nicht jedes Mal zufällig so eintritt.

Pge: /* Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung */

2020-10-03T21:25:31Z

Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung

← Older revision		Revision as of 23:25, 3 October 2020
Line 52:		Line 52:
	a. Beschreibe den experimentellen Ablauf der mRNA-Sequenzierung.		a. Beschreibe den experimentellen Ablauf der mRNA-Sequenzierung.

	Standardmäßig werden die Zellen aufgeschlossen, die mRNA extrahiert, aufgereinigt,		Standardmäßig werden die Zellen aufgeschlossen, die '''mRNA extrahiert''', aufgereinigt,
	in cDNA umbeschrieben, mit Adaptern getaggt, PCR, fragmentiert und dann mithilfe		in '''cDNA umbeschrieben''', mit Adaptern getaggt, PCR, fragmentiert ('''library preparation''') und dann mithilfe '''NGS sequenziert'''. Anschließen müssen die Daten noch '''prozessiert''' und '''alignt''' werden.
	NGS sequenziert.

	~~1. Zellaufschluss~~: ~~kann mit verschieden Möglichkeiten erreicht werden und je~~		Eine detaillierte Beschreibung wäre:
	~~nachdem ob man tierische, pflanzliche oder bakterielle Zellen hat ist der~~
	~~Prozess auch unterschiedlich. Man kann Methoden wie Chemolyse,~~
	~~alkalische Lyse, Sonifikation und andere verwenden~~

	2. ~~Zur mRNA-Extraktion~~ werden ~~normalerweise Kits verwendet~~. ~~Diese~~		1. Zellaufschluss: Dieser kann mit verschieden Möglichkeiten erreicht werden und je nachdem, ob man tierische, pflanzliche oder bakterielle Zellen hat, ist der Prozess auch unterschiedlich. Viele Methoden wie Chemolyse, alkalische Lyse, Sonifikation und andere können verwendet werden.
	~~basieren auf unterschiedlichen~~ Methoden wie ~~magnetic beads~~,
	~~Phasentrennung (mit Chloroform~~ und ~~Phenol) oder via Präzipitation mit~~
	~~Ethanol~~

	3. ~~Aufreinigung wird meistens über waschen~~ mit ~~Isopropanol gewährleistet~~		2. Zur mRNA-Extraktion werden normalerweise Kits verwendet. Diese basieren auf unterschiedlichen Methoden wie magnetic beads, Phasentrennung (mit Chloroform und Phenol) oder via Präzipitation mit
			Ethanol.

	4. ~~Die mRNA~~ wird ~~in cDNA umgeschrieben indem man reverse Transkriptase~~		3. Aufreinigung wird meistens über Waschen mit Isopropanol gewährleistet.
	~~hinzugibt. Um den mRNA-Strand in cDNA umzuschreiben muss der~~
	~~cDNA/RNA Hybrid zwischendurch einsträngig gemacht werden. Beim~~
	~~zweiten Stang wird dann dUTP anstatt dTTP verwendet, damit man die~~
	~~Stänge voneinander unterscheiden kann. Anschließend werden die 3‘~~
	~~Enden adenyliert um Ligation zu vermeiden~~.

	5. ~~Nun werden die Adapter an~~ den mRNA-~~komplimentäre~~ Strang ~~ligiert~~		4. Die mRNA wird in cDNA umgeschrieben, indem man reverse Transkriptase hinzugibt. Um den mRNA-Strang in cDNA umzuschreiben, muss der cDNA/RNA Hybrid wieder in Einzelsträngen getrennt werden. Bei der zweiten Synthese wird dann dUTP anstatt dTTP verwendet, damit man die Stränge voneinander unterscheiden kann. (forward/reverse) Anschließend werden die 3‘Enden adenyliert, um Ligation zu vermeiden.

	6. ~~In diesem Schritt~~ werden ~~alle cDNA Moleküle mit Adaptern amplifiziert.~~		5. Nun werden die Adapter an den mRNA-komplementären Strang ligiert.
	~~Dadurch wird gewährleistet, dass nur~~ mRNA-~~komplimentäre cDNA~~
	~~amplifiziert wird~~.

	7. ~~Hier~~ wird ~~die~~ cDNA ~~in viele stücke geschnitten, damit die Sequenzierung~~		6. In diesem Schritt werden alle cDNA Moleküle mit Adaptern amplifiziert.(PCR) Dadurch wird gewährleistet, dass nur mRNA-komplementäre cDNA amplifiziert wird.
	~~besser und schneller vonstatten geht~~.

	8. ~~NGS-Methoden wie Illumina oder Nanoporesequencing können solche~~		7. Außerdem wird die cDNA in viele Stücke geschnitten, damit die Sequenzierung schneller und effektiver möglich ist.
	~~Sequenzabschnittte schnell sequenzieren~~.

	9. Die generierten Reads aus der Sequenzierung werden prozessiert. Dazu gehören unter anderem das Trimmen und Filtern um read(-Abschnitte) ~~schlehcter~~ Qualität zu entfernen.		8. NGS-Methoden wie Illumina oder Nanoporesequencing können solche Sequenzabschnittte schnell sequenzieren.

			9. Die generierten Reads aus der Sequenzierung werden prozessiert. Dazu gehören unter anderem das Trimmen und Filtern um read(-Abschnitte) schlechter Qualität zu entfernen.

	10. Die prozessierten Reads werden alignt, damit sie anschließend ausgewertet werden können.		10. Die prozessierten Reads werden alignt, damit sie anschließend ausgewertet werden können.

	~~b. Was versteht man unter der Sequenziertiefe?~~

	~~Unter Sequenziertiefe versteht man die durchschnittliche Anzahl an reads pro Nukleotid der Sequenz. Eine hohe Sequenziertiefe bedeutet somit eine hohe Readanzahl im Verhältnis zum (Referenz)-Genoms.~~

	c. Wie unterscheiden sich die Ergebnisse einer hohen und einer niedrigen Sequenziertiefe		'''b''': Was versteht man unter der Sequenziertiefe?

			Unter Sequenziertiefe versteht man die durchschnittliche Anzahl an reads pro Nukleotid der Sequenz. Eine hohe Sequenziertiefe bedeutet somit eine hohe Read-Anzahl im Verhältnis zum (Referenz)-Genoms. Sie stellt damit einen Wert für Empfindlichkeit und Genauigkeit der Sequenzierung dar.



			'''c''': Wie unterscheiden sich die Ergebnisse einer hohen und einer niedrigen Sequenziertiefe
	bei der Daten-Interpretation?		bei der Daten-Interpretation?

	Eine „flache“ Sequenziertiefe zeigt lediglich stark exprimierte Gene an und ist statistischer		Eine „flache“ Sequenziertiefe zeigt lediglich stark exprimierte Gene an und ist statistischer
	weniger aussagekräftig. Eine tiefe Sequenziertiefe zeigt auch schwächer exprimierte Gene an		weniger aussagekräftig. Eine tiefe Sequenziertiefe zeigt auch schwächer exprimierte Gene an
	und ist, da n größer ist, statistischer aussagekräftiger.		und ist, da n größer ist, statistischer aussagekräftiger. Eine hohe Sequenziertiefe dauert natürlich länger und ist teurer, sodass sie für eine Suche nach hoch-exprimierten Gene nicht unbedingt nötig ist. (da hier ein mittlerer threshold ausreichend ist)




	Aufgabe 3: Sequenzierung mit FASTQ-Format		Aufgabe 3: Sequenzierung mit FASTQ-Format

	a. Ihr erhaltet Sequenzierdaten im FASTQ-Format. Die Datei hat 20 Millionen Zeilen.		'''a''': Ihr erhaltet Sequenzierdaten im FASTQ-Format. Die Datei hat 20 Millionen Zeilen.

	i) Wie viele „reads“ habt ihr erhalten? Erkläre, wieso.		i) Wie viele „reads“ habt ihr erhalten? Erkläre, wieso.
Line 115:		Line 109:
	exprimierten Gens zu quantifizieren?		exprimierten Gens zu quantifizieren?

	Nein, für ein schwach exprimiertes Gen sollte man ca. 100 Mio. Reads		Nein, für ein schwach exprimiertes Gen sollte man ca. 100 Mio. Reads anstreben. (da ein möglichst niedriger threshold die größte Chance hat auch schwach exprimierte Gene zu detektieren)
	~~haben~~


	b. In einer hypothetischen Zellpopulation sind ausschließlich folgende mRNA-Mengen		'''b''': In einer hypothetischen Zellpopulation sind ausschließlich folgende mRNA-Mengen
	(Anzahl an Molekülen) vorhanden:		(Anzahl an Molekülen) vorhanden:
	Transkript A: 5000		Transkript A: 5000
Line 134:		Line 129:

	Falls Ihr Binomialverteilung noch einmal wiederholen wollt, empfehle ich euch diesen [https://www.frustfrei-lernen.de/mathematik/binomialverteilung.html Link].		Falls Ihr Binomialverteilung noch einmal wiederholen wollt, empfehle ich euch diesen [https://www.frustfrei-lernen.de/mathematik/binomialverteilung.html Link].

			Andere mathematische Betrachtungsweise:

			5000+1000+10 = 6010

			Anzahl an Sequenzierungen, nach denen reun statistisch ein C vorkommt 6010 // 10 == 601

			Bei jedem 601. read würde also rein statistisch ein C rauskommen. Für eine Sequenziertiefe von 10 braucht man also rein statistisch 601 ** 10 = 6010. Nun greift aber natürlich wieder die oben angesprochene Binominalverteilung, da es ja nur ein statistisches Mittel ist und deswegen nicht jedes Mal zufällig so eintritt.

Pge: /* Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein */

2020-10-03T20:45:42Z

Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein

← Older revision		Revision as of 22:45, 3 October 2020
Line 45:		Line 45:

	SAM = '''S'''equence Alignment Map		SAM = '''S'''equence Alignment Map

	BAM = '''B'''inary Alignment Map		BAM = '''B'''inary Alignment Map

Pge at 20:45, 3 October 2020

2020-10-03T20:45:11Z

← Older revision		Revision as of 22:45, 3 October 2020
Line 35:		Line 35:
	Reads werden mithilfe der Burrows-Wheeler-Transformation an das dazugehörige		Reads werden mithilfe der Burrows-Wheeler-Transformation an das dazugehörige
	Genom angelegt. Dazu wird die Burrows-Wheeler-Transformation durchgeführt und		Genom angelegt. Dazu wird die Burrows-Wheeler-Transformation durchgeführt und
	der read wird als Sequenz in der BWT gesucht (siehe [[Übung 4\|Hausaufgabe 4 Aufgabe 1d]])		der read wird als Sequenz in der BWT gesucht. (siehe [[Übung 4\|Hausaufgabe 4 Aufgabe 1d]])

	In der Praxis können hier auch Tools wie TopHat genutzt werden.		In der Praxis können hier auch Tools wie TopHat genutzt werden.


			'''e''': Was versteht man unter SAM- und BAM- Format? Was ist der prinzipielle Unterschied?

			Enthält Information über die Sequenz-reads nach dem Alignment an ein Referenzgenom. SAM ist ein texbasiertes und BAM ein binäres Dateiformat. (binär = Computersprache --> 1010001101010101000101)

			SAM = '''S'''equence Alignment Map
			BAM = '''B'''inary Alignment Map

	== Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung ==		== Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung ==

Pge: /* Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein */

2020-10-03T20:40:56Z

Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein

← Older revision		Revision as of 22:40, 3 October 2020
Line 10:		Line 10:


	'''b''' Wie könnte man vorgehen, um mRNA anzureichern?		'''b''': Wie könnte man vorgehen, um mRNA anzureichern?

	Bei dieser Frage gibt es mehrere Lösungen, eine Antwort könnte so aussehen:		Bei dieser Frage gibt es mehrere Lösungen, eine Antwort könnte so aussehen:
Line 23:		Line 23:
	* Anreicherung über Poly (A) -Schwanz bei Eukaryoten		* Anreicherung über Poly (A) -Schwanz bei Eukaryoten

	'''c''' Ist es möglich, mRNA direkt zu sequenzieren? Wie ist das Vorgehen?		'''c''': Ist es möglich, mRNA direkt zu sequenzieren? Wie ist das Vorgehen?

	Ja, mittlerweile kann man mRNA auch mehr oder weniger direkt sequenzieren. Dabei		Ja, mittlerweile kann man mRNA auch mehr oder weniger direkt sequenzieren. Dabei
Line 31:		Line 31:
	Lichtemissionen über Zeit bestimmt werden.		Lichtemissionen über Zeit bestimmt werden.

	d. Wie werden einzelne „reads“ den dazugehörigen Genen zugeordnet?		'''d''': Wie werden einzelne „reads“ den dazugehörigen Genen zugeordnet?

	Reads werden mithilfe der Burrows-Wheeler-Transformation an das dazugehörige		Reads werden mithilfe der Burrows-Wheeler-Transformation an das dazugehörige

Pge: /* Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein */

2020-10-03T20:40:05Z

Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein

← Older revision		Revision as of 22:40, 3 October 2020
Line 3:		Line 3:
	== Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein ==		== Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein ==

	a. Was versteht man unter mRNA?		'''a''': Was versteht man unter mRNA?

	Messenger-RNA, auch mRNA ist ein einzelsträngiges Transkript einer genomischen		'''Messenger-RNA''', auch mRNA, ist ein einzelsträngiges Transkript einer genomischen
	Sequenz. Wird in Eukaryoten noch einmal prozessiert und gespleißt. Zu beachten ist,		Sequenz. Sie entsteht während der Transkription durch differentielle Genexpression (Transcriptomics) Wird in Eukaryoten noch einmal prozessiert und gespleißt. Zu beachten ist,
	dass die mRNA ~~aus Nukleotide~~ Ribose als Zucker ~~besitzen~~ und nicht Desoxyribose,		dass die mRNA Ribose als Zucker besitzt und nicht Desoxyribose (wie die DNA). Außerdem wird statt Thymin Uracil verwendet. Ihr Zweck ist es die Information für den Aufbau eines Proteins zu speichern und zu transportieren.
	wie die DNA.

	b. Wie könnte man vorgehen, um mRNA anzureichern?
			'''b''' Wie könnte man vorgehen, um mRNA anzureichern?

	Bei dieser Frage gibt es mehrere Lösungen, eine Antwort könnte so aussehen:		Bei dieser Frage gibt es mehrere Lösungen, eine Antwort könnte so aussehen:
Line 17:		Line 17:
	könnte zum Beispiel die RNA an magnetische microbeads mit Poly-A-Tag binden lassen		könnte zum Beispiel die RNA an magnetische microbeads mit Poly-A-Tag binden lassen
	und dann eine Magnetfilterung durchführen). Anschließend kann man die Probe anreichern indem man die rRNA abbaut.		und dann eine Magnetfilterung durchführen). Anschließend kann man die Probe anreichern indem man die rRNA abbaut.
	Die mRNA kann man dann aufkonzentrieren indem man in einer Vakuumkammer Wasser der Lösung verdampfen lässt und		Die mRNA kann man dann aufkonzentrieren indem man in einer Vakuumkammer Wasser der Lösung verdampfen lässt und somit die Konzentration an mRNA erhöht.
	somit die Konzentration an mRNA erhöht.

	c. Ist es möglich, mRNA direkt zu sequenzieren? Wie ist das Vorgehen?		Grundsätzlich lässt sich sagen:
			* Abbau von rRNA bei Prokaryoten, da diese 90% der RNA einer Zelle ausmacht
			* Anreicherung über Poly (A) -Schwanz bei Eukaryoten

			'''c''' Ist es möglich, mRNA direkt zu sequenzieren? Wie ist das Vorgehen?

	Ja, mittlerweile kann man mRNA auch mehr oder weniger direkt sequenzieren. Dabei		Ja, mittlerweile kann man mRNA auch mehr oder weniger direkt sequenzieren. Dabei
Line 33:		Line 36:
	Genom angelegt. Dazu wird die Burrows-Wheeler-Transformation durchgeführt und		Genom angelegt. Dazu wird die Burrows-Wheeler-Transformation durchgeführt und
	der read wird als Sequenz in der BWT gesucht (siehe [[Übung 4\|Hausaufgabe 4 Aufgabe 1d]])		der read wird als Sequenz in der BWT gesucht (siehe [[Übung 4\|Hausaufgabe 4 Aufgabe 1d]])

			In der Praxis können hier auch Tools wie TopHat genutzt werden.

	== Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung ==		== Aufgabe 2: RNA-Sequenzierung ==

Pge: Pge moved page Übung 5 to 5.Transkriptom RNA Seq 2

2020-05-19T12:01:50Z

Pge moved page Übung 5 to 5.Transkriptom RNA Seq 2

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Revision as of 14:01, 19 May 2020

Pge at 12:01, 19 May 2020

2020-05-19T12:01:34Z

← Older revision		Revision as of 14:01, 19 May 2020
Line 1:		Line 1:
	~~Der Übungszettel war am 16.05.2019 abzugeben.~~

	== Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein ==		== Aufgabe 1: mRNA und RNA-Sequenzierung allgemein ==