2 Transkriptom RNA Seq 1 - Revision history

Skl: /* Biologische Fragestellung */

2021-09-30T10:06:54Z

Biologische Fragestellung

← Older revision		Revision as of 12:06, 30 September 2021
Line 20:		Line 20:
	* cDNA wird sequenziert		* cDNA wird sequenziert
	* Sequenzunterschiede können analysiert werden <br>		* Sequenzunterschiede können analysiert werden <br>
	Dem Experiment liegt die Transkriptomanalyse zugrunde, welche eine quantitative und qualitative Bestimmung aller Transkriptionsaktivitäten ermöglicht. D.h. die Erfassung aller mRNA-Moleküle, wodurch auf die Aktivität bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zurückschließen lässt. Eine Trannskriptomanalyse (also die Erfassung der Gesamtheit aller in einer Zelle unter einer ~~bestimmte~~ Bedingung erzeugten mRNA Moleküle) lässt sich auf verschiedene Weisen durchführen. Eine Möglichkeit ist ein DNA-Microarray (s. unten). Eine andere Möglichkeit ist die RNA-Sequenzierung. Zum Ablauf RNA-Sequenzierung vergleiche [[5_Transkriptom RNA Seq 2]]. Für beide Analysemethoden ist jedoch die gleiche sample preparation notwendig.		Dem Experiment liegt die Transkriptomanalyse zugrunde, welche eine quantitative und qualitative Bestimmung aller Transkriptionsaktivitäten ermöglicht. D.h. die Erfassung aller mRNA-Moleküle, wodurch auf die Aktivität bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zurückschließen lässt. Eine Trannskriptomanalyse (also die Erfassung der Gesamtheit aller in einer Zelle unter einer bestimmten Bedingung erzeugten mRNA Moleküle) lässt sich auf verschiedene Weisen durchführen. Eine Möglichkeit ist ein DNA-Microarray (s. unten). Eine andere Möglichkeit ist die RNA-Sequenzierung. Zum Ablauf RNA-Sequenzierung vergleiche [[5_Transkriptom RNA Seq 2]]. Für beide Analysemethoden ist jedoch die gleiche sample preparation notwendig.
	# mRNA Extraktion aus dem Organismus		# mRNA Extraktion aus dem Organismus
	# mRNA wird durch Reverse Transkriptase zu cDNA umgeschrieben		# mRNA wird durch Reverse Transkriptase zu cDNA umgeschrieben

Skl: /* Lander-Waterman-Modell */

2021-09-27T08:58:51Z

Lander-Waterman-Modell

← Older revision		Revision as of 10:58, 27 September 2021
Line 92:		Line 92:
	* P gibt die Anzahl an Basenpaaren an nach denen statistisch ein gap erwartet wird		* P gibt die Anzahl an Basenpaaren an nach denen statistisch ein gap erwartet wird
	* dabei ist C die Coverage, also die Anzahl an reads an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die diese Stelle abdecken		* dabei ist C die Coverage, also die Anzahl an reads an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die diese Stelle abdecken
	~~</br>~~
	* rechnet man mit der gegeben Formel für P, erhält man erstmal die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines gaps, bei einer bestimmten Coverage		* rechnet man mit der gegeben Formel für P, erhält man erstmal die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines gaps, bei einer bestimmten Coverage
	* um die tatsächliche Anzahl an bp zu bekommen nach der statistisch ein gap auftritt, ist es notwenndig		* um die tatsächliche Anzahl an bp zu bekommen nach der statistisch ein gap auftritt, ist es notwenndig

Skl: /* Ablauf */

2021-09-26T11:04:55Z

Ablauf

← Older revision		Revision as of 13:04, 26 September 2021
Line 59:		Line 59:

	=== Ablauf ===		=== Ablauf ===
	Auf einer Oberfläche z.B. Glas befinden sich in einer bestimmten Anordnung immobilisierte DNA-Fragmente, so dass die Sequenz der DNA-Fragmente an jeder Position bekannt ist. Diese kurzen Oligonucleotide sind Sequenzabschnitte bekannter Gene des zu untersuchenden Organismus und deshalb komplementär zu cDNA-Sequenzen, dessen qualitative und quantitative Expression überprüft werden soll. Wobei sich nicht nur um ein ~~oliginukleotid~~ sondern um eine große Anzahl der selben ~~oligonucleotide~~ auf einen spot handelt. Nach der sample preparation erhält man cDNA. Die einzelsträngige cDNA ist floureszens markiert. Die Markierung kann z.B. durch die Verwendung von bereits floureszenzmarkierten dNTPs während der cDNA-Synthese erfolgen. Die cDNA der Probe wird auf den Chip aufgetragen und hybridisiert mit den komplementären Sequenzen. Nach der Fixierung werden die ungebundenen cDNA-Stränge heruntergewaschen. Überall dort wo dann Floureszenz zu messen ist, hat die cDNA an die komplementäre Oligonucleotid gebunden. Weil bekannt ist an welcher Stelle, welches Gensequenzoligonukleotid immobilisiert ist, kann so darauf geschlossen werden, welche Gene im untersuchten Organsimus exprimiert wurden. Die Intensität der Floureszenz korreliert mit der Anzahl an gebundenen cDNA Strängen pro Spot, wass wiederum mit dem Expressionslevel des Gens korreliert.		Auf einer Oberfläche z.B. Glas befinden sich in einer bestimmten Anordnung immobilisierte DNA-Fragmente, so dass die Sequenz der DNA-Fragmente an jeder Position bekannt ist. Diese kurzen Oligonucleotide sind Sequenzabschnitte bekannter Gene des zu untersuchenden Organismus und deshalb komplementär zu cDNA-Sequenzen, dessen qualitative und quantitative Expression überprüft werden soll. Wobei sich nicht nur um ein Oliginukleotid sondern um eine große Anzahl der selben Oligonucleotide auf einen spot handelt. Nach der sample preparation erhält man cDNA. Die einzelsträngige cDNA ist floureszens markiert. Die Markierung kann z.B. durch die Verwendung von bereits floureszenzmarkierten dNTPs während der cDNA-Synthese erfolgen. Die cDNA der Probe wird auf den Chip aufgetragen und hybridisiert mit den komplementären Sequenzen. Nach der Fixierung werden die ungebundenen cDNA-Stränge heruntergewaschen. Überall dort wo dann Floureszenz zu messen ist, hat die cDNA an die komplementäre Oligonucleotid gebunden. Weil bekannt ist an welcher Stelle, welches Gensequenzoligonukleotid immobilisiert ist, kann so darauf geschlossen werden, welche Gene im untersuchten Organsimus exprimiert wurden. Die Intensität der Floureszenz korreliert mit der Anzahl an gebundenen cDNA Strängen pro Spot, wass wiederum mit dem Expressionslevel des Gens korreliert.
	<br>		<br>
	Hauptsächlich werden sie genutzt um mehrer Proben gleichzeitig zu Vergleichen. Wobei es sich um den vergleich der Genexpressionsmuster unter versch. Bedingungen handelt.		Hauptsächlich werden sie genutzt um mehrer Proben gleichzeitig zu Vergleichen. Wobei es sich um den vergleich der Genexpressionsmuster unter versch. Bedingungen handelt.
Line 71:		Line 71:
	==== Nachteile ====		==== Nachteile ====
	Die Microarray-Technologie tritt heutzutage etwas in den Hintergrund, da die Methode einigen Einschränkungen unterliegt. Zum einen löst das Microarray die Sequenz nicht auf die Einzelbase auf, weshalb Mutanten und Splicevarianten oftmals nicht bestimmt werden können. Dies liegt daran, dass auch Sequenzen hybridisieren, die nicht 100% übereinstimmen. Außerdem beruht die Methode auf optischer Messung, was bedeutet, dass ein gewisses Maß an Hintergrundrauschen unvermeidbar ist und eine Messuntergrenze besteht. Somit kann es vorkommen, dass geringe Mengen an bestimmten Sequenzen nicht nachgewiesen werden können. Diese Methode besitzt zudem eine Messobergrenze, denn wenn alle Sonden in einem Spot hybridisiert haben, kann weitere komplementäre cDNA nicht binden und verfällt wenn sie herunter gewaschen wird. Zudem können nur Proben von Organismen verwendet werden, bei denen die Sequenz bereits bekannt ist.		Die Microarray-Technologie tritt heutzutage etwas in den Hintergrund, da die Methode einigen Einschränkungen unterliegt. Zum einen löst das Microarray die Sequenz nicht auf die Einzelbase auf, weshalb Mutanten und Splicevarianten oftmals nicht bestimmt werden können. Dies liegt daran, dass auch Sequenzen hybridisieren, die nicht 100% übereinstimmen. Außerdem beruht die Methode auf optischer Messung, was bedeutet, dass ein gewisses Maß an Hintergrundrauschen unvermeidbar ist und eine Messuntergrenze besteht. Somit kann es vorkommen, dass geringe Mengen an bestimmten Sequenzen nicht nachgewiesen werden können. Diese Methode besitzt zudem eine Messobergrenze, denn wenn alle Sonden in einem Spot hybridisiert haben, kann weitere komplementäre cDNA nicht binden und verfällt wenn sie herunter gewaschen wird. Zudem können nur Proben von Organismen verwendet werden, bei denen die Sequenz bereits bekannt ist.




	== Assembly ==		== Assembly ==

Skl: /* Biologische Fragestellung */

2021-09-26T10:03:54Z

Biologische Fragestellung

← Older revision		Revision as of 12:03, 26 September 2021
Line 1:		Line 1:

	== Biologische Fragestellung ==		== Biologische Fragestellung ==
	Das NAT8L Gen scheint im Metabolismus von Krebszellen eine Rolle zu spielen. Unser Projekt befasst sich mit Lungenkrebs. Daraus ~~folg folgende~~ Frage: Ist NAT8L in Lungenkrebszellen erhöht exprimiert ? <br>		Das NAT8L Gen scheint im Metabolismus von Krebszellen eine Rolle zu spielen. Unser Projekt befasst sich mit Lungenkrebs. Daraus folgt die Frage: Ist NAT8L in Lungenkrebszellen erhöht exprimiert ? <br>
	Die Frage impliziert weitere Überlegungen z.B. ob NAT8L essentiell für das Wachstum von Krebszellen ist und ob eine Inhibierung der NAT8L Expression die Tumorbildung hemmen würde.		Die Frage impliziert weitere Überlegungen z.B. ob NAT8L essentiell für das Wachstum von Krebszellen ist und ob eine Inhibierung der NAT8L Expression die Tumorbildung hemmen würde.

Skl: /* Lander-Waterman-Modell */

2021-09-25T13:57:08Z

Lander-Waterman-Modell

← Older revision		Revision as of 15:57, 25 September 2021
Line 98:		Line 98:
	* rechnet man mit der gegeben Formel für P, erhält man erstmal die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines gaps, bei einer bestimmten Coverage		* rechnet man mit der gegeben Formel für P, erhält man erstmal die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines gaps, bei einer bestimmten Coverage
	* um die tatsächliche Anzahl an bp zu bekommen nach der statistisch ein gap auftritt, ist es notwenndig		* um die tatsächliche Anzahl an bp zu bekommen nach der statistisch ein gap auftritt, ist es notwenndig
	<math> \frac{1}{P} </math>		<math> \frac{1}{P} </math> zu teilen

	G: Länge der Genomsequenz </br>		G: Länge der Genomsequenz </br>

Skl: /* Lander-Waterman-Modell */

2021-09-25T13:56:39Z

Lander-Waterman-Modell

← Older revision		Revision as of 15:56, 25 September 2021
Line 94:		Line 94:
	</big>		</big>
	* P gibt die Anzahl an Basenpaaren an nach denen statistisch ein gap erwartet wird		* P gibt die Anzahl an Basenpaaren an nach denen statistisch ein gap erwartet wird
			* dabei ist C die Coverage, also die Anzahl an reads an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die diese Stelle abdecken
	</br>		</br>
			* rechnet man mit der gegeben Formel für P, erhält man erstmal die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines gaps, bei einer bestimmten Coverage
	* ~~dabei ist C~~ die Coverage~~, also~~ die Anzahl an ~~reads an einer beliebigen Stelle~~ der ~~Sequenz~~, ~~die diese Stelle abdecken~~		* um die tatsächliche Anzahl an bp zu bekommen nach der statistisch ein gap auftritt, ist es notwenndig
			<math> \frac{1}{P} </math>

	G: Länge der Genomsequenz </br>		G: Länge der Genomsequenz </br>

Skl: /* Assembly */

2021-09-23T13:36:22Z

Assembly

← Older revision		Revision as of 15:36, 23 September 2021
Line 76:		Line 76:

	== Assembly ==		== Assembly ==
	Assembly ist ein Bioinformatisches Verfahren, bei dem überlappende reads zu Contiqs und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt werden. Wenn das Genom bereits bekannt ist können die Scaffolds an ein Referenzgenom aligned werden, wobei man diese Art der Assemblierung als Alignment oder Assemblierung mit Hilfe eines Referenzgenoms bezeichnet. Liegt keine Referenz ~~for~~, bezeichnet man sie als de novo Assemblierung.		Assembly ist ein Bioinformatisches Verfahren, bei dem überlappende reads zu Contiqs und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt werden. Wenn das Genom bereits bekannt ist können die Scaffolds an ein Referenzgenom aligned werden, wobei man diese Art der Assemblierung als Alignment oder Assemblierung mit Hilfe eines Referenzgenoms bezeichnet. Liegt keine Referenz vor, bezeichnet man sie als de novo Assemblierung.
	<br>		<br>
	[[File:Assembly.jpg\|600px\|center\|thumb]]		[[File:Assembly.jpg\|600px\|center\|thumb]]

Skl: /* Biologische Fragestellung */

2021-09-23T12:31:20Z

Biologische Fragestellung

← Older revision		Revision as of 14:31, 23 September 2021
Line 20:		Line 20:
	* cDNA wird sequenziert		* cDNA wird sequenziert
	* Sequenzunterschiede können analysiert werden <br>		* Sequenzunterschiede können analysiert werden <br>
	Dem Experiment liegt die Transkriptomanalyse zugrunde, welche eine quantitative und qualitative Bestimmung aller Transkriptionsaktivitäten ermöglicht. D.h. die Erfassung aller mRNA-Moleküle, wodurch auf die Aktivität bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zurückschließen lässt. Eine Trannskriptomanalyse (also die Erfassung der Gesamtheit aller in einer Zelle unter einer bestimmte Bedingung erzeugten mRNA Moleküle) lässt sich auf verschiedene Weisen durchführen. Eine Möglichkeit ist ein DNA-Microarray (s. unten). Eine andere Möglichkeit ist die RNA-Sequenzierung. Zum Ablauf RNA-Sequenzierung vergleiche [[5_Transkriptom RNA Seq 2]]. Für beide Analysemethoden ist jedoch die gleiche sample ~~preperation~~ notwendig.		Dem Experiment liegt die Transkriptomanalyse zugrunde, welche eine quantitative und qualitative Bestimmung aller Transkriptionsaktivitäten ermöglicht. D.h. die Erfassung aller mRNA-Moleküle, wodurch auf die Aktivität bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zurückschließen lässt. Eine Trannskriptomanalyse (also die Erfassung der Gesamtheit aller in einer Zelle unter einer bestimmte Bedingung erzeugten mRNA Moleküle) lässt sich auf verschiedene Weisen durchführen. Eine Möglichkeit ist ein DNA-Microarray (s. unten). Eine andere Möglichkeit ist die RNA-Sequenzierung. Zum Ablauf RNA-Sequenzierung vergleiche [[5_Transkriptom RNA Seq 2]]. Für beide Analysemethoden ist jedoch die gleiche sample preparation notwendig.
	# mRNA Extraktion aus dem Organismus		# mRNA Extraktion aus dem Organismus
	# mRNA wird durch Reverse Transkriptase zu cDNA umgeschrieben		# mRNA wird durch Reverse Transkriptase zu cDNA umgeschrieben

Skl at 09:12, 23 September 2021

2021-09-23T09:12:44Z

← Older revision		Revision as of 11:12, 23 September 2021
Line 86:		Line 86:
	Beim NGS wird eine gewünschte Target-Sequenz mithilfe der Shotgun-Methode sequenziert, sodass viele kleine DNA-Fragmente (reads) entstehen. Diese sind vollkommen ungeordnet und in keiner Weise miteinander in Bezug gesetzt. Durch das Assembly wird die eigentliche Sequenz aus den erhaltenen reads rekonstruiert und zusammengesetzt. Da NGS heutzutage vollem bei größeren Sequenzierungen hauptsächlich angewendet werden, ist immer eine Assemblierung des reads notwendig.		Beim NGS wird eine gewünschte Target-Sequenz mithilfe der Shotgun-Methode sequenziert, sodass viele kleine DNA-Fragmente (reads) entstehen. Diese sind vollkommen ungeordnet und in keiner Weise miteinander in Bezug gesetzt. Durch das Assembly wird die eigentliche Sequenz aus den erhaltenen reads rekonstruiert und zusammengesetzt. Da NGS heutzutage vollem bei größeren Sequenzierungen hauptsächlich angewendet werden, ist immer eine Assemblierung des reads notwendig.

	== ~~Sequenzabdeckung~~ ==		== Lander-Waterman-Modell ==
			* stellt die statistische Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von gaps dar
			* dient somit der Errechnung nicht abgedeckter Basenpaare bei einer Sequenzierung

			<big>
			P<sub>[nicht abgedecktes Bp]</sub> = e<sup><big>-c</big></sup>
			</big>
			* P gibt die Anzahl an Basenpaaren an nach denen statistisch ein gap erwartet wird
			</br>

			* dabei ist C die Coverage, also die Anzahl an reads an einer beliebigen Stelle der Sequenz, die diese Stelle abdecken

	G: Länge der Genomsequenz </br>		G: Länge der Genomsequenz </br>
	N: Anzahl der reads </br>		N: Anzahl der reads </br>
Line 95:		Line 106:
	<math> C= \frac{N*L}{G} </math>		<math> C= \frac{N*L}{G} </math>

	~~== Lander-Waterman-Modell ==~~
	~~Mathematisches Modell zur Errechnung, durch Sequenzierung, nicht abgedeckter Basenpaare.</br>~~

	~~<big>~~
	~~P<sub>[nicht abgedecktes Bp]</sub> = e<sup><big>-c</big></sup>~~
	~~</big>~~
	~~</br>~~

	Beispiele:</br>		Beispiele:</br>

Skl: /* Assembly */

2021-09-21T18:55:48Z

Assembly

← Older revision		Revision as of 20:55, 21 September 2021
Line 76:		Line 76:

	== Assembly ==		== Assembly ==
	Assembly ist ein Bioinformatisches Verfahren, bei dem überlappende reads zu Contiqs und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt werden. Wenn das Genom bereits bekannt ist können die Scaffolds an ein Referenzgenom aligned werden, wobei man diese Art der Assemblierung als Alignment oder Assemblierung mit Hilfe eines Referenzgenoms ~~beschreibt~~. Liegt keine Referenz for, bezeichnet man sie als de novo Assemblierung.		Assembly ist ein Bioinformatisches Verfahren, bei dem überlappende reads zu Contiqs und anschließend zu Scaffolds zusammengesetzt werden. Wenn das Genom bereits bekannt ist können die Scaffolds an ein Referenzgenom aligned werden, wobei man diese Art der Assemblierung als Alignment oder Assemblierung mit Hilfe eines Referenzgenoms bezeichnet. Liegt keine Referenz for, bezeichnet man sie als de novo Assemblierung.
	<br>		<br>
	[[File:Assembly.jpg\|600px\|center\|thumb]]		[[File:Assembly.jpg\|600px\|center\|thumb]]